登革熱患者尿液中病毒核酸檢測及其臨床意義.pdf

1、登革熱是由登革病毒（DENV）引起的一種急性傳染病，是全球熱帶及亞熱帶地區(qū)主要的公共衛(wèi)生問題，對人類健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重要威脅。登革熱需要借助實驗室診斷才能確診，通過RT-PCR方法檢測DENV-RNA，是一種快速、敏感、特異的實驗室診斷方法，其常用的檢測標本為血標本，但存在病毒血癥期短，采集血標本有創(chuàng)、不方便等缺點，尿液較血標本有經(jīng)濟、方便、安全無創(chuàng)等優(yōu)點，尿液中DENV-RNA檢測能否用于登革熱的確診？國外研究很少，國內(nèi)尚無研

2、究。因此，明確尿液中DENV-RNA檢測對登革熱確診的價值，對于提高登革熱的診治水平有重要意義。
　　研究目的：
　　本研究擬建立一種通過尿液檢測 DENV-RNA的實驗室方法，并探討其臨床意義。
　　對象：
　　1.實驗組：2013年8-11月廣州市第八人民醫(yī)院收治的57例登革熱住院病人，其中登革熱（DF）42例，重癥登革熱（SDF）15例。采集病人73份血漿和病程早中晚期的158份系列尿液標本開展實驗研究。<

3、br>　　1.1 57例登革熱病人平均年齡為37.5歲（7-74歲）。男性有35例，女性有22例。
　　1.2 73份血漿對應51例登革熱病人（人均1-2份），在病程早期（發(fā)病1-5天）、病程中期（發(fā)病6-9天）和病程晚期（發(fā)病10-14天）分別有35份，33份，5份血漿；還有6例病人未采集到血漿。
　　1.3 158份尿液對應57例登革熱病人（人均2-3份），在病程早期、中期和晚期分別有56份、76份和26份尿液。

4、　　2.對照組：包括非登革熱病人組和健康人組各10例，每人各有1份尿液標本，共20份。非登革熱病人組包括艾滋病病人組5例，乙肝病人組5例。
　　方法：
　　1.確診登革熱患者查閱病歷資料，對57例登革熱病人的臨床表現(xiàn)及病原學檢測結(jié)果進行匯總，依據(jù)2009年WHO頒布的《登革熱診斷、治療以及防控指南》，可判斷57例登革熱病人均達到實驗室確診標準，并可區(qū)分DF患者和SDF患者。
　　2.標本的收集與保存
　　2.1

5、采集尿液，每份留取5-10ml，在2h內(nèi)以2000轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清液分裝至1.5ml微量離心管中，-80℃冰箱中保存，避免反復凍融；
　　2.2 采集新鮮抗凝血5ml，迅速分離血漿，分裝至1.5ml微量離心管中，-80℃冰箱中保存。
　　3.采用ELISA檢測血漿中抗DENV-IgM和IgG抗體使用澳大利亞PanBio公司生產(chǎn)的PANBIO DENGUE IgM CAPTURE ELISA試劑盒和PANBIO D

6、ENGUE IgG CAPTURE ELISA試劑盒，分別檢測登革熱病人急性期血漿中的抗DENV-IgM和IgG抗體。
　　4.登革熱病人初次感染和二次感染的判斷若抗 DENV-IgM陽性同時抗 DENV-IgG陰性，可判斷為初次感染；若抗DENV-IgG陽性，且標本采集的時間處于發(fā)熱期，無論抗DENV-IgM結(jié)果如何，可判斷為二次感染。
　　5.采用RT-PCR方法檢測尿液和血漿中DENV-RNA將一管尿液標本從-80℃冰

7、箱取出，室溫溶解后混勻，用1ml移液器取出200ul尿液標本至無菌微量離心管中，依照達安核酸提取試劑盒和達安RT-PCR試劑盒操作步驟，制備RT-PCR反應體系，再用7500 Fast Real-time PCR system（美國 ABI公司）擴增登革病毒核酸特異片段，依據(jù)擴增曲線和CT值，判定出陰陽性結(jié)果。血漿中DENV-RNA檢測需要標本量、試劑盒及操作步驟，與尿液中DENV-RNA檢測相同。
　　6.腎損害的評估方法通過國

8、內(nèi)公認的結(jié)合患者的性別、年齡、血肌酐、白蛋白、血尿素氮等幾個指標，并根據(jù)中國人的飲食校正專用軟件，計算內(nèi)生肌酐清除率，當內(nèi)生肌酐清除率小于或等于70ml/min，可判斷存在腎損害。
　　7.統(tǒng)計學方法SPSS13.0軟件，Pearson卡方檢驗，連續(xù)性校正法，F(xiàn)isher確切概率法。P值小于0.05有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果：
　　1.血漿中抗DENV-IgM和抗DENV-IgG檢測結(jié)果抗DENV-IgM陽性的有51例，

9、抗DENV-IgG陽性的有8例。
　　2.初次感染和二次感染的判斷結(jié)果初次感染病人有43例，二次感染病人有8例。余6例病人沒有收集到血漿，無法判斷初次感染和二次感染。
　　3.尿液中DENV-RNA檢測結(jié)果
　　3.1 尿液中DENV-RNA檢測陽性率57例登革熱病人行尿液DENV-RNA檢測，40例病人出現(xiàn)陽性，陽性率為70.2％。對照組20份尿液中DENV-RNA檢測結(jié)果均為陰性。
　　3.2 不同發(fā)病天數(shù)尿

10、液中DENV-RNA檢測結(jié)果發(fā)病第1天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為0（N=0/0）；發(fā)病第2天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為0（N=0/0）；發(fā)病第3天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為60%（N=3/5）；發(fā)病第4天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為56%（N=10/18）；發(fā)病第5天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為61%（N=19/31）；發(fā)病第6天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為50%（N=12/24）；

11、發(fā)病第7天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為80%（N=16/20）；發(fā)病第8天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為67%（N=14/21）；發(fā)病第9天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為45%（N=5/11）；發(fā)病第10天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為67%（N=6/9）；發(fā)病第11天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為29%（N=2/7）；發(fā)病第12天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為67%（N=4/6）；發(fā)病第13天，尿

12、液中DENV-RNA檢測陽性率為0（N=0/2）；發(fā)病第14天，尿液中DENV-RNA檢測陽性率為50%（N=1/2）。結(jié)果顯示，最早在發(fā)病第3天能檢測到病毒核酸，最長發(fā)病第14天能檢測到。除了發(fā)病第9天、第11天和第13天外，尿液中DENV-RNA檢測陽性率均高于50%。其中在發(fā)病第7-8天尿液中DENV-RNA檢測陽性率最高，為73.2%（N=30/41）。
　　3.3 病程早中晚期尿液中DENV-RNA檢測結(jié)果在病程早期、中

13、期和晚期，尿液中DENV-RNA檢測陽性率分別為57.1%、61.8%和50%。結(jié)果顯示在病程中期尿液中DENV-RNA檢測陽性率較高。
　　4.尿液與血漿中DENV-RNA檢測結(jié)果對比
　　4.1 尿液與血漿中DENV-RNA檢測陽性率比較血漿中DENV-RNA檢測陽性率為96.1%（N=49/51），尿液中DENV-RNA檢測陽性率為70.2%（N=40/57），P值等于0.000（Pearson卡方檢驗），統(tǒng)計學有顯著

14、差異，結(jié)果顯示尿液中DENV-RNA檢測陽性率較血漿低。還有6例未采集到血漿標本的病人，尿液中DENV-RNA檢測均為陽性，結(jié)果顯示尿液中DENV-RNA檢測可以作為一種實驗室診斷方法的補充。
　　4.2 不同時段尿液與血漿中DENV-RNA檢測結(jié)果比較
　　4.2.1 血漿與尿液中最長分別在發(fā)病第12天、第14天檢測出DENV-RNA。
　　4.2.2 在病程早期，血漿中DENV-RNA檢測陽性率（100%）高于尿液

15、（57.1%），兩者比較，P值等于0.000（Pearson卡方檢驗），有統(tǒng)計學差異。在病程中期，發(fā)病第7天尿液中DENV-RNA檢測陽性率高于血漿。在病程晚期，未收集到血漿標本的前提下，尿液中DENV-RNA檢測可作為確診的手段。
　　4.3 血漿陰性病人尿液中可檢測到DENV-RNA有1例血漿中DENV-RNA檢測陰性的病人，尿液中DENV-RNA檢測陽性。有1例病人在發(fā)病第12天，血漿中DENV-RNA檢測陰性，而尿液中DE

16、NV-RNA檢測陽性。
　　5.分析尿液中DENV-RNA檢測陽性率的相關(guān)因素
　　5.1 DF和SDF與尿液中DENV-RNA檢測陽性率關(guān)系DF和SDF患者，尿液中DENV-RNA陽性率分別為76.2%和53.3%，兩者比較，P值等于0.183，無統(tǒng)計學差異。結(jié)果顯示尿液中DENV-RNA檢測陽性率與DF和SDF無關(guān)。
　　5.2 初次感染和二次感染與尿液中DENV-RNA檢測陽性率的關(guān)系初次感染和二次感染的登革熱患

17、者，尿液中DENV-RNA檢測陽性率分別為67.4%，75%，兩者比較，P值等于0.994，無統(tǒng)計學差異。結(jié)果顯示尿液中DENV-RNA檢測陽性率與初次感染和二次感染無關(guān)。
　　5.3 腎損害與尿液中DENV-RNA檢測陽性率的關(guān)系有腎損害的病人只有42.9%出現(xiàn)尿液中DENV-RNA檢測陽性，而尿液中DENV-RNA檢測陽性的病人只有22.2%存在腎損害。結(jié)果顯示尿液中DENV-RNA檢測陽性率與腎損害無關(guān)。
　　結(jié)論：<