受體介導(dǎo)的甘露糖化蛋白抗原的攝取、遞呈及淋巴細(xì)胞激活.pdf

1、以T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體的抗腫瘤機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。在產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程中，抗原的特性和樹突狀細(xì)胞(DC)的功能狀態(tài)是抗原呈遞的關(guān)鍵。隨著DC的成熟，DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力亦增強(qiáng)。目前，基于DC的腫瘤疫苗研究是腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 原癌基因HER-2/neu的產(chǎn)物在人類多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞中異常過表達(dá)，它參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性化轉(zhuǎn)移，而在正常組織和細(xì)胞中，HER-2/neu則低表達(dá)或不

2、表達(dá)。因此，HER-2/neu是免疫治療的良好靶分子。HER-2/neu配體結(jié)合區(qū)第2結(jié)構(gòu)域(RLD2)是HER-2/neu蛋白的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域。在本研究中，根據(jù)DC表面甘露糖受體可介導(dǎo)高效的抗原內(nèi)化，我們表達(dá)、純化了HER-2/neuRLD2蛋白，并對其進(jìn)行了甘露糖修飾，以增強(qiáng)DC對抗原的攝取、呈遞，促進(jìn)DC成熟，進(jìn)一步增強(qiáng)針對抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而為新型甘露糖化腫瘤疫苗的研制提供理論依據(jù)。 本課題研究的主要內(nèi)容包括：第一部分

3、RLD2蛋白表達(dá)及純化采用本室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTIG-TrxA/RLD2轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)，獲得陽性轉(zhuǎn)化克隆，并獲得TrxA與RLD2蛋白在大腸桿菌中的可溶性共表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫印記分析可被抗HER-2/neu特異性抗體識(shí)別。經(jīng)離子交換層析和鎳親和層析純化，RLD2蛋白的純度達(dá)85％。用質(zhì)譜法分析RLD2蛋白的分子量，與預(yù)期大小相符。HER-2/neuRLD2蛋白的高效可溶性表達(dá)為蛋白抗原的甘露糖化修飾打下了基礎(chǔ)。

4、 第二部分RLD2蛋白的糖基化修飾和熒光素標(biāo)記采用化學(xué)方法對純化的RLD2蛋白(L2)進(jìn)行了甘露糖化修飾，通過質(zhì)譜法對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，RLD2擬糖蛋白(mL2)在質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)甘露糖修飾蛋白的分子量預(yù)期峰形。隨后對修飾與未修飾的蛋白用FITC標(biāo)記，以利于下一步甘露糖化受體介導(dǎo)的DC抗原攝取和提呈的實(shí)驗(yàn)研究。 第三部分人外周血來源DC的誘導(dǎo)從健康志愿者的外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4及脂多糖(

5、LPS)的誘導(dǎo)獲得DC，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對DC成熟的特征進(jìn)行了分析。 第四部分糖基化抗原誘導(dǎo)DC成熟及促進(jìn)抗原攝取的研究將熒光素標(biāo)記的糖基化或未糖基化抗原(mL2及L2)分別作用于未成熟DC，通過流式細(xì)胞術(shù)分析DC表型的變化及抗原攝取，發(fā)現(xiàn)mL2能夠通過甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)化途徑促進(jìn)DC的抗原攝取效率，并能有效地促進(jìn)DC成熟。 第五部分糖基化抗原增強(qiáng)DC誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤效應(yīng)用糖基化抗原沖擊未成熟DC，可強(qiáng)有力地刺激T細(xì)胞的