柑橘果實粒化變異體的遺傳背景及其性狀形成的機理研究.pdf

1、柑橘體細(xì)胞融合技術(shù)有效地克服了柑橘有性雜交過程中遇到的珠心胚干擾、雌雄敗育等生殖障礙,近二十年來已創(chuàng)造了超過250例的不同種間、屬間體細(xì)胞雜種材料。由于柑橘體細(xì)胞融合實際上是一個半篩選體系,理論上再生植株包括三類:四倍體體細(xì)胞雜種,二倍體胞質(zhì)雜種以及懸浮親本再生植株。而原生質(zhì)體再生植株很容易產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異,因而能創(chuàng)造出一些特別的種質(zhì)資源。本研究以由‘朋娜臍橙愈傷原生質(zhì)體’+‘紅橘葉肉原生質(zhì)體’通過PEG融合后再生的6棵具有果實早期

2、粒化癥狀的變異體植株為材料,首先從遺傳背景上分析其來源,而后以朋娜臍橙(Citrussinensis[L.]Osbeck)作為對照分析了兩者果實在發(fā)育過程中細(xì)胞壁代謝的變化規(guī)律和相關(guān)基因的表達(dá),并采用SSH結(jié)合反向Northern技術(shù)分析了兩者差異表達(dá)的基因。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.流式細(xì)胞儀的倍性測定顯示變異植株均為二倍體,而幾種分子標(biāo)記,即核SSR,RAPD,cpSSR,mtCAPS和mtRFLP的結(jié)果表明,它們的DN

3、A均來源于朋娜臍橙而缺少紅橘的遺傳信息,但在線粒體基因組上單株之間以及與朋娜臍橙都存在著一定程度的變異。而葉型指數(shù)與朋娜沒有顯著差異而與紅橘差異顯著,其中單株之間有差異；枝條與朋娜臍橙相似但其中單株1-3無刺而單株4-6有刺；其花期與朋娜臍橙一致而早于紅橘,花的形態(tài)也與親本不同；果實形態(tài)及生理分析表明其與兩親本有明顯差異,果實表面粗糙,無種子,果實無臍,汁胞粒化現(xiàn)象嚴(yán)重,果實著色略早,可固、可滴定酸、Vc含量均低于朋娜。由此我們推測其可

4、能是由朋娜臍橙懸浮細(xì)胞再生形成的體細(xì)胞無性系變異體。
　　 2.測定了不同發(fā)育時期?；蛔凅w與朋娜臍橙果實汁胞和果皮中果膠類物質(zhì)和纖維素類物質(zhì)的組成與含量變化以及相關(guān)水解酶類的活性變化。結(jié)果表明兩者果皮中果膠類物質(zhì)以及纖維素類物質(zhì)沒有顯著差異,但在突變體果實汁胞中原果膠,纖維素,半纖維素,木質(zhì)素含量顯著高于朋娜臍橙,這些均是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重要組成物質(zhì)。其代謝途徑的三個關(guān)鍵酶,果膠甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纖維素酶活性在果實發(fā)育過

5、程均明顯低于朋娜臍橙同時期的酶活性,特別是成熟后期。
　　 3.利用Real-timePCR測定?；蛔凅w與朋娜臍橙果實中細(xì)胞壁代謝途徑關(guān)鍵酶基因(果膠甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纖維素酶)以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白在幾個不同采樣時期的表達(dá)。結(jié)果與酶活測定結(jié)果趨勢一致,表明汁胞?；c果實中這幾種酶的活動密切相關(guān)。綜合以上研究結(jié)果,認(rèn)為?；赡苁怯捎诶w維素代謝相關(guān)的基因以及抑制蛋白的表達(dá)發(fā)生變化,一方面導(dǎo)致纖維素酶活性變低,使纖

6、維素、半纖維素分解速度減小,另一方面纖維素合成增多,分解速度小于合成速度,導(dǎo)致?；l(fā)生,同時由于果膠酶水解原果膠生成脫甲酯果膠質(zhì),其中一部分被鈣橋、酯鍵固定,果膠被凝膠化,進一步加重?；?br>　　 4.為了獲得與?；蛔凅w果實特異性狀相關(guān)的基因,我們構(gòu)建了其與朋娜臍橙果實的抑制性差減文庫(SSH文庫),然后采用反向Northern技術(shù)從文庫中篩選在果實發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因。在對差異表達(dá)的基因進行測序以及序列分析后,我們總共得到

7、357條非重復(fù)性的基因,64.4％的非冗余序列(207條單一序列與23條contig)。其中與細(xì)胞代謝、初生代謝、定位以及大分子代謝等相關(guān)的基因數(shù)目最多。這些基因所屬的代謝途徑包括丙酮酸代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、三羧酸代謝途徑及糖酵解代謝途徑等。此外,還對發(fā)現(xiàn)的12個與?；誀羁赡芟嚓P(guān)的酶和蛋白候選基因,即果膠甲酯酶抑制蛋白(PMEIP)、果膠酸鹽水解酶(PL)、幾丁質(zhì)酶(Chitinase)、葡聚糖酶(Glucanase)、β-半

8、乳糖苷酶(Gal)、擴展蛋白(Exp)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、赤霉素調(diào)節(jié)蛋白(GRP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Retrotransposon)和鈣離子結(jié)合蛋白(CaBP),對它們在6個不同發(fā)育時期的基因表達(dá)活性變化進行了Real-timePCR檢測,發(fā)現(xiàn)它們也與粒化有一定的關(guān)聯(lián)。
　　 本研究通過對從果實生長發(fā)育的整個階段進行研究,從細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)含量的變化到相關(guān)合成及水解酶類的動