Pin1與CyclinD1在肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、前言腫瘤的發(fā)生是在基因和基因上水平多步驟、多因素的過程，最終導(dǎo)致不可控制的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和死亡。在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中，主要的調(diào)節(jié)機制是由多種蛋白激酶指導(dǎo)的絲/蘇-脯氨酸的磷酸化，如：周期素依賴激酶。蛋白中磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序存在順/反兩種構(gòu)型，這種構(gòu)型的改變通常為磷酸化所抑制，但能夠特異地被Pin1(人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶)催化，Pin1通過與磷酸化的絲/蘇-脯氨酸位點結(jié)合引起構(gòu)象改變，使其活化。Pin1的催化活性引起的構(gòu)象改變是

2、在蛋白磷酸化之后，所以，這種構(gòu)型的改變在催化活性、蛋白的去磷酸化、蛋白和蛋白之間的相互作用、亞細(xì)胞的定位、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生長的調(diào)控中起著重要作用。因此，磷酸化依賴Pin1的調(diào)節(jié)機制是一個新的重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 Pin1在正常組織中表達(dá)有限，而在多種腫瘤組織中的表達(dá)則明顯高于其來源的正常組織，而且這種改變與臨床分期、臨床預(yù)后密切相關(guān)。目前關(guān)于Pin1在肺癌組織中的表達(dá)情況及其與CyclinD1的相互關(guān)系的研究甚少，為此，本實

3、驗對肺鱗癌和肺腺癌及其癌旁正常肺組織中的Pin1和CyclinD1的表達(dá)情況進行研究，并分析二者與臨床病理因素的關(guān)系，以探討它們在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與意義。 材料與方法1.材料45例肺鱗癌和24例肺腺癌及癌旁正常組織來自遼寧省腫瘤醫(yī)院1980年～2001年和中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院胸外科2005年5月～2005年8月手術(shù)手術(shù)切除存檔蠟塊。組織均經(jīng)4％甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。其中的10例肺鱗癌和10例肺腺癌及10例癌旁正常組

4、織用于WesternBlot。 2.主要試劑和來源實驗藥品：濃縮型兔抗人Pin1多克隆抗體、即用型CyclinD1單克隆抗體、梯度蛋白標(biāo)準(zhǔn)均購自美國SantaCruze公司；即用型S-P超敏免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、β-action一抗和濃縮型辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 3.方法3.1免疫組織化學(xué)染色：檢測Pin1和CyclinD1的表達(dá)采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化

5、物酶免疫組化法(S-P法)。結(jié)果判定：(1)Pin1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核。根據(jù)其染色強度計分：無染色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；按染色陽性細(xì)胞百分率計分：陽性細(xì)胞百分率＜25％者為0，陽性細(xì)胞百分率25％～49％者為1，陽性細(xì)胞百分率50％～74％者為2，≥75％者為3。最后判斷標(biāo)準(zhǔn)為上述兩項得分相乘，得分≥3分為過度表達(dá)。(2)CyclinD1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核，無明顯陽性細(xì)胞為陰性(-)，

6、陽性細(xì)胞數(shù)小于20％為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)大于20％為陽性(++)。其中弱陽性表達(dá)(+)歸入陰性(-)中。 3.2WesternBlot：檢測Pin1在正常肺組織、肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)。取新鮮樣品(1-2克)加5倍裂解緩沖液，剪碎、勻漿超聲處理，高速低溫離心提取上清蛋白，電泳，轉(zhuǎn)印，經(jīng)封閉后加相應(yīng)的一抗、二抗及顯色試劑檢測。結(jié)果判定為轉(zhuǎn)印膜上出現(xiàn)清晰的棕色條帶，并對蛋白條帶作灰度值測定。 4.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用PEMS

7、3.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件，對Pin1和CyclinD1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系用卡方檢驗，P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果1.Pin1在正常肺組織、肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)Pin1在癌旁正常肺組織不表達(dá)或呈微弱的核表達(dá)。在肺鱗癌和肺腺癌癌細(xì)胞的胞漿和/或胞核內(nèi)呈陽性或強陽性表達(dá)。 WesternBlot結(jié)果顯示：Pin1在10例肺鱗癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺組織中有不同程度的表達(dá)，在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁正常

8、組織。 2.CyclinD1在正常肺組織、肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)CyclinD1正常肺組織不表達(dá)。在肺鱗癌和肺腺癌癌細(xì)胞的胞漿和/或胞核內(nèi)呈陽性或強陽性表達(dá)。 WesternBlot結(jié)果顯示：CyclinD1在10例肺鱗癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺組織中有不同程度的表達(dá)，在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織。 3.Pin1、CyclinD1蛋白的表達(dá)與肺鱗癌、肺腺癌的臨床病理特征關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示，P

9、in1的表達(dá)與患者的性別、年齡、組織類型、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等臨床病理學(xué)參數(shù)無顯著相關(guān)。CyclinD1的表達(dá)與分化程度負(fù)相關(guān)(P=0.0274)，而與患者的性別、年齡、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等臨床病理學(xué)參數(shù)無顯著相關(guān)。Pin1和CyclinD1二者的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P=0.0048)。 討論絲\蘇-脯氨酸殘基的磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的主要機制。例如：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被癌基因Neu/Ras活化的多種脯氨酸蛋白激酶激活，最終

10、經(jīng)由多種轉(zhuǎn)錄因子包括：E2F、c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB而加強CyclinD1的轉(zhuǎn)錄，并且CyclinD1的穩(wěn)定性由后轉(zhuǎn)錄磷酸化位點Thr-286-pro調(diào)控。絲\蘇-脯氨酸基序的結(jié)構(gòu)和功能進一步為脯氨酰異構(gòu)酶Pin1所調(diào)節(jié)。因此，依賴Pin1的特異磷酸化是一個新的重要的信號機制。 CyclinD1在腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，CyclinD1的敲出能夠抑制Ha/Ras或c-Neu/HER2/Eer

11、B2引起的鼠的乳腺癌的發(fā)生。這些結(jié)果暗示：CyclinD1是Neu/Ras引起的腫瘤，發(fā)生機制中必不可少的下游靶點，一個重要機制是絲\蘇-脯氨酸基序的磷酸化。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Pin1在人類許多腫瘤中過表達(dá)，它的表達(dá)水平與CycinD1的水平密切相關(guān)。更為重要的是Pin1能夠通過激活c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子而提高CyclinD1的表達(dá)水平，Pin1也可直接結(jié)合CyclinD1磷酸化的Thr286-P

12、ro位點，并通過抑制其入漿而穩(wěn)定CyclinD1。除此之外，在除去Pin1成年女性，乳腺上皮失去伴隨懷孕的強增殖能力，表型和除去CyclinD1相似。最后，經(jīng)由E2F的Neu/Ras信號途徑加強Pin1的轉(zhuǎn)錄。Pin1的轉(zhuǎn)錄也促進Neu/Ras轉(zhuǎn)染乳腺上皮的轉(zhuǎn)化表型。這些結(jié)果提供了體內(nèi)體外證據(jù)證實了Pin1在早期腫瘤發(fā)生中尤為重要的作用和其吸引人的抗癌靶點。 本研究中，Pin1和CyclinD1在肺鱗癌和肺腺癌中過度表達(dá)，且Pi

13、n1與CyclinD1在肺癌中的表達(dá)顯著正相關(guān)。我們實驗證實了Pin1是Neu/Ras激活的經(jīng)由CyclinD1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，所以Pin1是腫瘤發(fā)生中必不可少的關(guān)鍵因素。 結(jié)論1.Pin1在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織，CyclinD1在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織。 2.Pin1的表達(dá)與患者的性別、年齡、組織類型、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等臨床病理學(xué)參數(shù)無顯著相關(guān)。CyclinD1的