游離二氧化硅粉塵誘轉(zhuǎn)的肺肌成纖維細胞IGF-Ⅱ受體的表達及意義.pdf

1、矽肺是在生產(chǎn)過程中長期吸入大量含游離二氧化硅生產(chǎn)性粉塵所引起的以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的全身性疾病。肺纖維化前期主要表現(xiàn)為肺泡巨噬細胞,中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞增多,后期則表現(xiàn)為大量的間質(zhì)細胞增生及基質(zhì)成分增多、基質(zhì)膠原進行性積聚。在增生的細胞中,除肺泡上皮細胞外主要為成纖維細胞。目前認為,矽肺形成過程中巨噬細胞是游離SiO2粉塵的直接效應(yīng)細胞。巨噬細胞受刺激后可釋放多種細胞因子如白細胞介素、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子、纖維

2、粘連蛋白等,刺激成纖維細胞增生、網(wǎng)織纖維及膠原纖維的合成。雖然肺組織已有的纖維化病變難以消除,但肺纖維化是一個慢性、進行性的病理反應(yīng)過程,探索肺纖維化發(fā)病的分子機制以延緩或阻斷纖維化發(fā)展仍具有重要的實際意義。 在纖維化的發(fā)展過程中,肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞起關(guān)鍵作用。肌成纖維細胞是種在超微結(jié)構(gòu)和功能上兼有成纖維細胞和平滑肌細胞兩者特征的非典型的成纖維細胞,其特征性表達為僅α-平滑肌肌動蛋白。大量研究證明,肺纖維化形成過程中,

3、轉(zhuǎn)化生長因子β發(fā)揮重要作用。胰島素樣生長因子Ⅱ受體在哺乳動物多個組織均有表達,IGF-ⅡR可以結(jié)合前轉(zhuǎn)化生長因子β并刺激前轉(zhuǎn)化生長因子β裂解和活化形成轉(zhuǎn)化生長因子β。也有研究提示IGF-Ⅱ可能通過直接作用于自身或鄰近癌細胞的IGF-ⅡR,放大細胞持續(xù)生長信號,加速癌細胞的自主性生長。
　　本研究擬通過體外分離培養(yǎng)SD大鼠腹腔巨噬細胞、肺成纖維細胞,觀察肺成纖維細胞暴露于不同濃度的游離SiO2粉塵刺激巨噬細胞后的培養(yǎng)上清,鑒定肺成纖

4、維細胞是否可被誘轉(zhuǎn)為肌成纖維細胞;而后從mRNA、蛋白水平水平上分析誘導(dǎo)后的肺成纖維細胞IGF-ⅡR表達,探討IGF-ⅡR在誘導(dǎo)后的肺成纖維細胞中的表達水平及意義,為進一步研究矽肺的發(fā)生、發(fā)展機制及治療措施提供參考依據(jù)。
　　方法：1.建立大鼠腹腔巨噬細胞和成纖維細胞體外原代培養(yǎng)模型。成熟SD大鼠腹腔灌洗獲取巨噬細胞;用胰蛋白酶消化肺組織,分離和純化肺成纖維細胞,在37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng)。利用MTT法描述肺成纖維細胞生長

5、曲線。
　　2.肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化鑒定。以無血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑配制游離SiO2粉塵工作液,終濃度分別為0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml,對離體原代培養(yǎng)的大鼠巨噬細胞染毒24h,離心收集Mφ培養(yǎng)上清,并作用于肺成纖維細胞24h,免疫組織化學法檢測細胞α-SMA蛋白的表達。
　　3.游離SiO2粉塵刺激巨噬細胞的上清對IGF-ⅡR基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響。游離SiO2粉塵工作液對

6、離體原代培養(yǎng)的大鼠巨噬細胞染毒24h,離心收集Mφ培養(yǎng)上清,并作用于肺成纖維細胞24h:(1)提取成纖維細胞內(nèi)總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),以GAPDH為內(nèi)參照,檢測成纖維細胞內(nèi)IGF-ⅡRmRNA水平。(2)免疫組織化學法檢測細胞IGF-ⅡR蛋白的表達。4.統(tǒng)計學分析。運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(analysis ofvariance,ANOVA)、Bonfferoni兩兩比較、Levene方差齊

7、性檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析(檢驗水準α=0.05)。
　　結(jié)果：:1.本研究分離培養(yǎng)的SD大鼠腹腔巨噬細胞、肺成纖維細胞體外生長良好,可以用于體外實驗研究。
　　2.肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化鑒定:以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml游離SiO2粉塵刺激Mφ的培養(yǎng)上清作用于肺成纖維細胞后24h后,免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn),高濃度刺激組α-SMA表達明顯高于對照組,且隨游離SiO2粉塵濃度增高,

8、肺成纖維細胞表達α-SMA的量也逐漸增多。
　　3.肌成纖維細胞IGF-ⅡR mRNA表達結(jié)果:不同濃度游離SiO2粉塵刺激Mφ的培養(yǎng)上清作用于肺成纖維細胞24h后,實驗組肺成纖維細胞IGF-ⅡR mRNA相對表達量均高于對照組,低劑量組(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);75μg/ml、100μg/ml游離SiO2粉塵組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4.肌