脊柱黃韌帶骨化分子生物學和生物力學機制研究.pdf

1、目的脊柱黃韌帶骨化(Ossification of ligamentum flavum，0LF)本質(zhì)屬于軟骨內(nèi)成骨，但是，關(guān)于其病因和發(fā)病機制的分歧較多，目前尚無有效的藥物防治方法，手術(shù)是唯一治療手段，但手術(shù)風險大且遠期效果不確切。如何預(yù)測骨化是否進展，如何防止骨化的繼續(xù)發(fā)展和術(shù)后復(fù)發(fā)，是臨床上亟待解決的問題，這些問題的解決都必須建立在對發(fā)病機制清晰了解的基礎(chǔ)上。因此，從多角度對其發(fā)病機制進行研究是非常必要的。已知局部解剖力學和生長因子

2、BMPs、TGFβ是黃韌帶骨化的可能因素，黃韌帶骨化初期有豐富的血管增生，血管生成是骨化的必備條件。調(diào)節(jié)血管生成的細胞因子眾多，主要有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、骨形成蛋白(BMPs)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板源性生長因子(PDGF)和環(huán)氧化酶2(COX2)等，推測BMPs和TGFβ可能是通過促進局部血管生成而發(fā)揮促韌帶骨化的作用。VEGF是迄今為止已知的最強的促血管

3、生成因子，COX2是炎癥因子PGE2介導(dǎo)的血管生成的關(guān)鍵酶。基于以上研究成果，實驗從血管生成和黃韌帶局部解剖學角度，研究血管生成和胸椎椎板傾斜角在黃韌帶骨化中的作用和臨床意義，從宏觀生物力學到微觀分子生物學研究脊柱黃韌帶骨化發(fā)病的可能中心環(huán)節(jié)，提出藥物預(yù)防和控制的可能性，以期更好地指導(dǎo)臨床，為黃韌帶骨化的綜合施治尋找可能的途徑。 方法：脊柱后路手術(shù)切取的正常(NL，5例)、退變(DL，9例)和骨化(OL，l8例)的黃韌帶標本，作

4、HE染色，地衣紅染色，SP法作vEGF、COX2、ON、CD34免疫組化染色，觀察比較各組纖維組成、血管生成和各因子的表達,分析OL組CD34表達與CT、MRI 影像學表現(xiàn)的關(guān)系。 組織塊結(jié)合酶消化法體外培養(yǎng)骨化(13例)和正常(5例)黃韌帶細胞(LFCs)，觀察其生物學特性，作ALP染色和透射電鏡觀察，在常規(guī)、低氧和不同濃度塞來昔布藥物作用下，采用SP法作VEGF、COX2免疫細胞化學染色和ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液VEG

5、F濃度，RT-PCR法測定骨化(6例)和正常(3例)LFCs的VEGF、COX2和BMP-2mRNA表達，分析各因子對骨化的作用及其相互關(guān)系。 以直立狀態(tài)下脊柱矢狀面重力線為參照，分析不同節(jié)段黃韌帶所受力矩大小，測量干燥胸椎標本(20具共233個椎骨)椎板傾斜角(LSA)，并分析其角度分布與TOLF患者(22例共90個骨化灶)黃韌帶骨化好發(fā)部位之間的關(guān)系。將黃韌帶與其相鄰上下椎板視為“椎板-黃韌帶-椎板復(fù)合體”，從理論上分析黃

6、韌帶在不同LSA時受力情況。 結(jié)果：DL和OL組彈力纖維含量明顯低于NL組[q(N-D)=4.68，q(N-O)=6.70]，OL組在韌帶與骨化的交界處可見豐富血管增生，OL組VEGF和COX2表達IOD值高于DL組[t(VEGF)：2.19，t(COX2)=2.47]，DL和OL組ON表達差異無顯著性[t(0N)=0.36]，DL和OL組MVD高于NL組[q(N-D)：3.79，q(N-O)=6.10]，DL和OL組差異無顯著

7、性[q(D-O)=2.37]，MVD在CT和MRI的兩種不同分型中差異有顯著性[t(CT)=4.24，t(MRI)=4.62]。 共體外培養(yǎng)黃韌帶細胞17株，正常LFCs5株，骨化LFCs l2株。細胞從貼附于培養(yǎng)瓶內(nèi)的韌帶組織小塊萌出緩慢，約需6—10d可見有細胞從組織小塊邊緣萌出，呈典型成纖維細胞形態(tài)。OL組常規(guī)培養(yǎng)細胞可形成不透亮鈣化結(jié)節(jié)，ALP染色陽性，免疫細胞化學染色COX2陽性，VEGF弱陽性，NL組表達均陰性。O

8、L組LFCs低氧培養(yǎng)24h后COX2和VEGF均強陽性表達，塞來昔布10μmol/L組培養(yǎng)72h后，COX2和vEGF表達弱陽性，20—100μmol/L組表達均陰性。常規(guī)培養(yǎng)組在細胞80％匯合時上清液VEGF濃度顯著高于鈣化結(jié)節(jié)形成時測定值(t=2.60)，低于低氧培養(yǎng)組(t=5.43)，塞來昔布組隨藥物濃度增加，上清液vEGF濃度整體呈下降趨勢，塞來昔布抑制細胞生成VEGF，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。細胞存活率在藥物濃度20μmol/L組顯

9、著低于對照組(p<0.05)，40、80、100μmol/L組進一步降低(p<0.001)，藥物抑制作用具有濃度依賴性。透射電鏡可見OL組LFCs細胞器和分泌小泡豐富，蛋白質(zhì)合成旺盛。OL組LFCs的VEGF、COX2和BMP-2mRNA表達陽性，口檢驗q<,(VEGf-COX2)>：1.1 8，q<,(VEGF-BMP2)>=2.94，q<,(COX2-BMP2)>=1.76，P值均大于0.05，即三者之間相對表達量無統(tǒng)計學差異，NL

10、組LFCs三者表達陰性。 胸椎LSA與相應(yīng)椎體水平面成鈍角，分布以T7-T10為波谷段，TOLF分布以T8-T10為波峰段，兩者分布具有相關(guān)性，LSA最小的下胸段與TOLF好發(fā)部位大體一致。黃韌帶受軸向牽拉力為F*sinα，在椎板垂直的理想狀態(tài)下黃韌帶受力為F，角α越大，黃韌帶受到的張力越小，反之亦然。 結(jié)論1)反復(fù)微小創(chuàng)傷→韌帶修復(fù)增生→局部肥厚低氧→VEGF、COX2異常分泌→血管生成→韌帶纖維化、骨化。黃韌帶骨化是

11、一個連續(xù)性發(fā)展的病理過程，血管生成可能是啟動骨化過程的最終步驟，有重要的臨床影像學和治療學意義。 2)體外培養(yǎng)黃韌帶骨化患者的非骨化部位的黃韌帶細胞可表達成骨細胞表型，低氧能刺激黃韌帶細胞異常分泌COX2和VEGF，選擇性COX2抑制劑塞來昔布能抑制黃韌帶細胞的分裂增殖和COX2和VEGF的產(chǎn)生，提示血管生成抑制劑可能有預(yù)防術(shù)后骨化復(fù)發(fā)和控制骨化進展的作用，為臨床綜合施治提供可能的途徑。 3)VEGF、COX2和BMP-

12、2三者關(guān)系密切，互相作用，共同促使黃韌帶內(nèi)血管生成和骨化發(fā)生。 4)脊柱生理曲度是0LF多發(fā)于胸椎和HLF多發(fā)于頸、腰椎的解剖學基礎(chǔ)，胸椎黃韌帶所受的張應(yīng)力是牽拉性骨贅形成的力學因素，胸椎LSA的不同和由此作用于LF牽拉力的不同可能是TOLF多發(fā)于下胸段的解剖學和生物力學因素之一。 5)反復(fù)機械應(yīng)力引起脊柱黃韌帶細胞分子生物學改變，宏觀力學機制通過微觀分子生物學機制來發(fā)揮作用，兩者是統(tǒng)一體，不應(yīng)割裂開來研究黃韌帶骨化的