小劑量復合抗原誘導多病程EAE大鼠長病程中髓鞘損傷及α-硫辛酸的保護作用.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis， MS)是中樞神經系統(tǒng)常見的脫髓鞘疾病之一，其臨床特征表現(xiàn)為復發(fā)-緩解交替，并進行性加重，但其發(fā)病機制尚不十分清楚，因而，目前還沒有找到十分有效的治療方法。病理學研究證實，多發(fā)性硬化初期就存在髓鞘損傷，但隨著時間的推移髓鞘反復損傷而修復不完全，使得軸索得不到保護，繼發(fā)性損傷，導致臨床癥狀進行性加重。因此，保護髓鞘、促進髓鞘再生是治療多發(fā)性硬化的有效方法。α-硫辛酸作為一種抗氧化劑、

2、免疫調節(jié)劑，可以減輕中樞神經系統(tǒng)的氧化和免疫損傷，進而可能對髓鞘具有一定的保護和促進再生作用。髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein， MBP)是髓鞘的重要組成部分，對髓鞘膜狀板層結構的維持有重要作用。當髓鞘結構被破壞時，MBP從髓鞘上游離，造成髓鞘板層松散或脫失。因此，檢測腦脊液中MBP的含量變化，可以間接了解中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘程度。由于大鼠的腦脊液含量少且不易獲取，我們采取直接檢測EAE大鼠的腰膨大組織MBP蛋白的含

3、量變化，來直接了解長病程中髓鞘的損傷程度及α-硫辛酸是否對髓鞘損傷有保護作用，并通過檢測免疫細胞及細胞因子來探討多發(fā)性硬化的發(fā)病機制和α-硫辛酸的保護機制。
　　 方法：實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)是研究多發(fā)性硬化的理想動物模型。本實驗用小劑量豚鼠脊髓勻漿為抗原免疫雌性Wistar大鼠建立EAE模型，發(fā)病后當天開始給予α-硫辛酸（α-li

4、poic acid， LA）腹腔注射（100mg/kg/d，共7d），并進行長達180天的觀察和研究。運用神經功能評分、HE染色、三色染色、電鏡、Western Blot等多種方法定性和定量觀察大鼠中樞神經系統(tǒng)髓鞘脫失情況來反映LA的治療效果。同時，運用ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)

5、的水平，流式細胞術檢測調節(jié)性T細胞(Tregulatory cells， Treg)即CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達，以對免疫機制進行初步探討。
　　 結果：
　　 1 自然病程組和LA干預組大鼠的180d的平均每天積累神經功能評分相比P＜0.01有顯著差異（圖2）。佐劑組無發(fā)病。因發(fā)病后才給予藥物干預，故兩組大鼠潛伏期沒有明顯差別，但復發(fā)率相比x2=10.797，P=0.001.P＜0.01有顯著差異（表1

6、）。說明LA有減輕EAE病情、減少復發(fā)的作用。
　　 2 自然病程組與LA干預組發(fā)病后7d時HE染色可見炎細胞浸潤和血管袖套現(xiàn)象(圖4)。
　　 3 三色染色（圖5）和電鏡觀察（圖7）均可見EAE大鼠髓鞘板層松散，電鏡觀察發(fā)病后180d自然病程組髓鞘崩解，有碎片堆積（圖8A）；LA干預組髓鞘板層損傷較輕，可見再生的薄層髓鞘（圖8B）。佐劑組髓鞘板層致密(圖6)。
　　 4 Western Blot顯示(表2，圖9

7、，圖10)發(fā)病后7d時三組MBP蛋白表達量無明顯差別；與同期佐劑對照組比較自然病程組發(fā)病后180d時MBP表達下降，t=6.800,P=0.002,P＜0.01，有明顯差異；硫辛酸干預組發(fā)病后180d時MBP表達與同期佐劑對照組比較也下降t=3.389，P=0.028,P＜0.05，有統(tǒng)計學差異。自然病程組發(fā)病后180d時與硫辛酸干預組同期相比MBP表達更低，t=4.035,P=0.016,P＜0.05有統(tǒng)計學差異。說明LA對髓鞘有遠期

8、的保護作用。
　　 5 ELISA檢測結果顯示(表3、4、5，圖11、12、13)：無論自然病程組還是LA治療組的大鼠血清中TNF-α的表達量在發(fā)病后7d和14d都高于佐劑對照組，P＜0.01，有顯著差異；LA治療組7d和14d與同期自然病程組比較均下調，發(fā)病后7d(P＜0.01)、發(fā)病后14d(P＜0.05)，說明LA對TNF-α有下調作用。TGF-β的表達量無論自然病程組還是LA治療組的發(fā)病后7d和14d都低于佐劑對照組，分

9、別為P＜0.01和P＜0.05:LA治療組7d和14d與同期自然病程組比都上調，發(fā)病后7d(P＜0.01)、發(fā)病后14d(P＜0.05)，說明LA對TGF-β有上調作用。流式細胞術檢測全血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數(shù)量與TGF-β水平的變化趨勢一致。自然病程組和LA治療組大鼠于發(fā)病后14d較發(fā)病后7d時TNF-α有不同程度的降低，TGF-β和CD4+CD25+Foxp3+T有不同程度的上升。說明三因子與疾病的嚴重程度有關。