抗人分泌性白細胞蛋白酶抑制劑單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、第一部分:
　　背景與目的:人分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(human secretory leukocyte protease inhibitor, hSLPI)是一種低分子量的嗜彈性蛋白酶抑制劑,為粘膜分泌的非糖基化蛋白。SLPI來源于上皮細胞、肥大細胞、中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞,廣泛分布在皮膚、呼吸道、胃腸道、唾液腺和生殖腺。SLPI能抑制中性粒細胞的彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、肥大細胞的類糜蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶,在變

2、態(tài)反應性疾病和炎癥中起重要作用。檢測SLPI的水平有利于深入了解在變態(tài)反應性疾病和粘膜炎癥發(fā)病機制中,蛋白酶和蛋白酶抑制劑平衡的問題。因此,制備廉價、有效的抗hSLPI單克隆抗體(mAb)具有重要意義。
　　方法:以hSLPI為免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤NS-1細胞融合。通過間接ELISA法篩選可特異性分泌抗hSLPI mAb的雜交瘤細胞。采用Ig類與亞類鑒定試劑盒鑒定mAb的Ig亞類;通過ELISA

3、、Western blot、免疫組織化學染色法、流式細胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡技術鑒定mAb的特異性。
　　結果:獲得10株可穩(wěn)定分泌抗hSLPI mAb的雜交瘤細胞,其分泌的mAb均為IgM。Western blot分析表明,此mAb所識別的靶分子的相對分子質量(Mr)約為12000。免疫組織化學染色表明,mAb與肺、結腸及包皮組織中的上皮細胞、疑似肥大細胞,扁桃體組織中的疑似肥大細胞的反應性呈陽性。流式細胞儀分析顯示,10

4、株mAb與人肺腺癌細胞系A549細胞中的SLPI均呈陽性反應。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,熒光標記的陽性反應物主要位于A549細胞的胞漿內。
　　結論:成功地制備抗hSLPI mAb,為變態(tài)反應性疾病和炎癥性疾病的研究工作提供了有用的試劑。
　　第二部分:
　　背景與目的:白細胞介素-28A(Interleukin28A, IL-28A)是由病毒或雙鏈RNA誘導外周血單個核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、上皮細胞和內皮細胞等

5、多種細胞產生的細胞因子,與白細胞介素-28B(Interleukin28B, IL-28B)、白細胞介素-29(Interleukin29, IL-29)組成一組新的白介素。IL-28A通過誘導細胞產生多種細胞內蛋白,參與抗病毒感染、抗細胞增殖和免疫調節(jié)過程。檢測IL-28A水平有利于了解其在病毒性疾病、腫瘤和其他疾病中的作用與機制。因此,有必要制備廉價、有效的抗人白介素-28A(hIL-28A)單克隆抗體(mAb)。
　　方法:

6、利用重組人白介素-28A融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤NS-1細胞融合。用純化的hIL-28A作為檢測抗原,通過ELISA篩選分泌抗hIL-28A的雜交瘤細胞株。采用Ig類與亞類鑒定試劑盒鑒定mAb的Ig亞類;通過ELISA、Western blot、免疫組織化學染色法、流式細胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡技術鑒定mAb的特異性。
　　結果:獲得8株穩(wěn)定分泌抗hIL-28A mAb的雜交瘤細胞,但mAb均

7、與hIL-29有交叉反應。8株mAb的類別均為IgM。Western blot分析表明,此mAb所識別的靶分子的相對分子質量(Mr)約為19000。免疫組織化學染色表明,mAb與包皮和肺組織中的上皮細胞、結腸組織中的疑似巨噬細胞呈陽性反應。流式細胞儀分析顯示,8株mAb與人臍靜脈內皮細胞系HUVEC細胞的反應均呈陽性。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到熒光標記的陽性反應物主要位于HUVEC細胞胞漿內。
　　結論:成功地制備抗hIL-28A