角蛋白8參與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管上皮細(xì)胞凋亡、線粒體損傷及其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種以肝內(nèi)中小膽管進(jìn)行性破壞為特征的自身免疫性膽汁淤積性肝臟疾病。約90％-95%的PBC患者可檢測(cè)到抗線粒體抗體（Anti-mitochondrial antibodies，AMA），線粒體何種成分失去免疫耐受引起PBC發(fā)病并不清楚。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜損傷、卷曲以及外翻使細(xì)胞內(nèi)容物外漏，線粒體成分降解清除障礙，產(chǎn)生免疫原性片段可能誘發(fā)了PBC。
　　

2、角蛋白（Cytokeratin，CK）是細(xì)胞骨架蛋白中間絲家族中數(shù)量最多和最重要的成員，不僅具有保護(hù)細(xì)胞、維持線粒體正常結(jié)構(gòu)的功能，而且參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等重要生理病理過(guò)程。角蛋白缺失或異常表達(dá)與疾病密切相關(guān)。研究表明，過(guò)表達(dá)CK8會(huì)引發(fā)小鼠慢性胰腺炎；CK8-/-的小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎；乳腺癌中CK8的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　近年來(lái)，有學(xué)者認(rèn)為CK8缺失或表達(dá)異常同肝臟疾病發(fā)病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟損傷時(shí)，CK8以及CK18 m

3、RNA和蛋白的表達(dá)量可升高3倍[8,29]。CK8-/-小鼠可出現(xiàn)慢性肝炎，肝細(xì)胞損傷、凋亡[30]，C57/B1 CK8-/-小鼠約94％胚胎期死亡并伴廣泛肝出血、肝損傷[31]，F(xiàn)VB／N CK8-/-小鼠55％有正常的生存期，但在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)為輕微肝炎、肝巨噬細(xì)胞異常和肝細(xì)胞增生，予膠原酶灌注后出現(xiàn)明顯肝壞死，對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性明顯增加[9]。另外有研究報(bào)道，CK8表達(dá)異?？赡芡琍BC發(fā)病相關(guān)。PBC患者體內(nèi)可檢測(cè)到抗CK8自

4、身抗體，PBC患者肝臟CK8/CK18的蛋白含量可升高2-4倍。國(guó)外研究也證實(shí)在PBC患者中CK8突變明顯升高，CK8缺失或表達(dá)異常與PBC的嚴(yán)重程度相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)CK8-/-小鼠肝細(xì)胞線粒體形態(tài)、功能發(fā)生變化，且血清抗線粒體抗體（Anti-mitochondrial antibodies，AMA）陽(yáng)性。以上研究提示：CK8缺失或異常表達(dá)可能參與PBC的發(fā)病，但是，CK8缺失或表達(dá)異常在PBC發(fā)病中扮演的角色并不清楚。
　　

5、本研究探討CK8是否通過(guò)影響線粒體功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與PBC發(fā)病。
　　【目的】
　　1、研究過(guò)表達(dá)以及干擾CK8對(duì)人膽管細(xì)胞RBE凋亡的影響；
　　2、研究過(guò)表達(dá)以及干擾CK8對(duì)人膽管細(xì)胞RBE線粒體形態(tài)和功能的影響；
　　3、探討CK8表達(dá)異常通過(guò)何種信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　【方法】
　　1、構(gòu)建CK8過(guò)表達(dá)以及干擾慢病毒載體，感染人膽管細(xì)胞RBE，建立CK8過(guò)表達(dá)以及干擾細(xì)胞系，采用RT-P

6、CR和Western Blot檢測(cè)人膽管細(xì)胞RBE中CK8的表達(dá)量；
　　2、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)以及干擾CK8人膽管細(xì)胞RBE凋亡水平變化；
　　3、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)以及干擾CK8人膽管細(xì)胞RBE線粒體的形態(tài)和功能的變化；
　　4、通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)研究AKT信號(hào)通路在過(guò)表達(dá)以及干擾CK8凋亡中作用；5、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析GCDC作用對(duì)人

7、膽管細(xì)胞RBE凋亡的影響；
　　6、采用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析GCDC作用對(duì)線粒體的形態(tài)和功能的變化；
　　7、通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)研究AKT信號(hào)通路在GCDC作用后CK8表達(dá)異常的人膽管細(xì)胞RBE凋亡中作用；
　　【結(jié)果】
　　1、CK8表達(dá)異常促進(jìn)人膽管細(xì)胞RBE凋亡
　　RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞角蛋白量發(fā)生相應(yīng)改變。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果顯示，過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞角蛋白成團(tuán)狀、且分布不均，細(xì)胞核固縮、碎裂。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、CK8表達(dá)異常參與人膽管細(xì)胞RBE線粒體形態(tài)和功能變化
　　激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞線粒體絲狀斷裂，分布不均。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞的活性氧含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、CK8表達(dá)異常介導(dǎo)人膽

9、管細(xì)胞RBE AKT信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡
　　Western Blot結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)或干擾CK8細(xì)胞AKT的磷酸化蛋白水平明顯下調(diào)，總蛋白水平無(wú)明顯變化；AKT下游的抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，抗凋亡蛋白Cleaved caspase-3明顯上調(diào)。
　　4、GCDC促進(jìn)CK8表達(dá)異常人膽管細(xì)胞RBE角蛋白破壞、線粒體損傷以及細(xì)胞凋亡
　　激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GCDC作用細(xì)胞角蛋白成團(tuán)狀、且分布不均，細(xì)胞