次聲腦損傷谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA變化規(guī)律研究.pdf

1、次聲是頻率為10-4～20Hz的彈性機械縱波，其頻率與機體組織器官的共振頻率相近，可直接引起機體組織及臟器的共振，產(chǎn)生一系列的生物學效應，造成一定程度的損傷。以往研究表明，次聲作用后可引起腦組織谷氨酸過度釋放或重吸收障礙，導致腦組織中谷氨酸蓄積，誘發(fā)神經(jīng)元的一系列病理損害。細胞外沒有使谷氨酸代謝失活的酶,而使谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)滅活的唯一途徑是通過神經(jīng)細胞的再攝取和吸收，其中起主要作用的是谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，因此谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達變化在神經(jīng)元

2、損傷機制中起著重要作用。谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白也稱興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（Excitatoryaminoacidtransporter,EAAT），主要存在于神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞質(zhì)膜上。EAAT參與谷氨酸的重吸收，研究其在次聲作用后的mRNA表達變化及其作用，可為次聲腦損傷的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　實驗一大鼠次聲腦損傷模型的建立
　　目的：建立一種可靠的、簡便易行的大鼠次聲腦損傷模型，為進一步深入進行神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理學和分子

3、生物學研究奠定良好的基礎(chǔ)。
　　方法：清潔級成年雄性SD大鼠80只由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（軍）2004-005]，體質(zhì)量(280±15)g，隨機分為正常對照組、次聲作用1、7及l(fā)4次組，每組20只。采用本校與航天工業(yè)部41所其同研制的次聲壓力倉，實驗用8Hz130dB的次聲。除對照組每日在次聲壓力倉內(nèi)滯留2h而無次聲作用外，其余各組均按分組次數(shù)每日在次聲壓力倉內(nèi)全身作用2h。以神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴重程度評分（

4、neurologicalseverityscore，NSS）及病理學方法觀察損傷結(jié)果。結(jié)果：在各實驗組隨機抽取大鼠10只，分別在完成次聲作用后1h、24h、48h進行NSS評分。統(tǒng)計學分析表明，1次組與對照組無顯著性差異，7次和14次組，大鼠NSS評分則顯著高于對照組(p<0.01)。14次組，大鼠在損傷后1h高于7次在相應時刻的NSS評分(p<0.05)。在次聲作用后1h光鏡下觀察，1次組，未發(fā)現(xiàn)腦皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的病理學損傷，細胞

5、結(jié)構(gòu)完整。7次和14次組，大鼠皮質(zhì)部分神經(jīng)元出現(xiàn)損傷改變。包括：核濃縮、胞漿深染、細胞結(jié)構(gòu)不清，損傷神經(jīng)元廣泛分布于皮質(zhì)，可見損傷細胞和小血管周圍水腫。次聲1次組與對照組比較，損傷神經(jīng)元無顯著差異。次聲7次、14次組損傷神經(jīng)元明顯增加。電鏡標本在透射電鏡下觀察。次聲1次組，透射電鏡下可以觀察到皮質(zhì)結(jié)構(gòu)中的微血管周圍輕度水腫。部分神經(jīng)元低染，細胞膜輕度改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，高爾基氏體的基質(zhì)輕度融合。線粒體數(shù)量基本正常，形態(tài)上輕度擴張。軸索

6、內(nèi)少量線粒體出現(xiàn)空泡樣改變，髓殼形態(tài)基本正常。次聲7次組，透射電鏡下可以觀察到皮質(zhì)結(jié)構(gòu)中的微血管周圍輕度水腫、滲出明顯。神經(jīng)元細胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜變形，部分神經(jīng)元出現(xiàn)染色質(zhì)邊集，核固縮現(xiàn)象。胞漿中有大量微絲形成，并出現(xiàn)少量的脂褐素。細胞器數(shù)目明顯減少，線粒體腫脹，嵴斷裂、減少、消失、空泡樣變。神經(jīng)元軸突髓殼崩解，表現(xiàn)為髓殼樣改變。14次與7次組比較，上述神經(jīng)元的損傷征象范圍較廣，程度加重，固縮壞死神經(jīng)元的數(shù)量增多。結(jié)論：應用該模型次聲

7、對大鼠腦有確切損傷效果，模型具有良好的可重復性、穩(wěn)定性及易操作性,為今后實驗打下良好基礎(chǔ)。
　　實驗二大鼠次聲腦損傷后谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（EAAT）mRNA的變化
　　目的：通過實驗，了解大鼠次聲腦損傷損傷后EAATmRNA的表達規(guī)律及其對神經(jīng)元損傷的意義，以及各亞型EAAT在此類損傷中發(fā)揮的異同作用。方法：清潔級成年雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(280±15)g，分為正常對照組、次聲作用1、7及l(fā)4次組，每組20只，實驗用8Hz

8、130dB次聲制備腦損傷模型。設(shè)計EAAT各亞型引物，取正常大鼠1只，通過腦組織勻漿提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒酶切線性化、DNA回收、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學方法制備各亞型正義及反義探針。隨機抽取各實驗組動物各10只，腦組織冰凍切片，進行RNA探針原位雜交實驗，對腦片進行灰度分析。取各實驗組動物各10只，取大腦海馬組織，勻漿后提取總RNA，采用各亞型引物進行熒光實時定量PCR法檢測，根據(jù)Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值成反比線性關(guān)系確定各組

9、實驗動物皮質(zhì)組織mRNA表達量，明確其變化規(guī)律。結(jié)果：與同時間對照組比較，8Hz130dB的次聲作用2h后，EAAT1mRNA、EAAT2mRNA表達水平即發(fā)生了上調(diào)，連續(xù)7天作用后，上調(diào)明顯，14天組則略有恢復,但表達水平仍高于對照組。EAAT3mRNA表達水平在次聲作用前后變化無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：8Hz130dB的次聲腦損傷后，EAAT1、EAAT2mRNA表達增加，EAAT1、EAAT2合成加速，有利于機體清除蓄積的谷氨酸，防止其