Galectin-3在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)及調(diào)節(jié).pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥，EMT)是一種婦科常見病，主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)和不孕。內(nèi)異癥是引起不孕的重要原因之一，內(nèi)異癥引起的不孕約占不孕總數(shù)的30～50％，內(nèi)異癥患者不孕發(fā)生率為非內(nèi)異癥人群的20倍。由于內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制及與不孕癥的關(guān)系尚不清楚，單純藥物或手術(shù)治療對(duì)其生育狀況的改善效果并不理想，故需進(jìn)一步研究內(nèi)異癥引起不孕的機(jī)理，為內(nèi)異癥不孕尋找新的診治靶點(diǎn)。輔助生育技術(shù)結(jié)果研究結(jié)果顯示內(nèi)異癥不孕患者的胚胎著床率顯著低于非內(nèi)異癥婦女；而對(duì)內(nèi)

2、異癥動(dòng)物模型的研究也表明內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜缺少子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)記，如整合素α<,v>β<,3>。因此，有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜容受性的改變可能是其導(dǎo)致不孕的重要原因之一。Galectin-3(Ga1-3)是一種糖結(jié)合蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，參與多種生理和病理過程。近年來Ga1-3在細(xì)胞黏附、分化、遷移和增殖方面的作用使其在生殖領(lǐng)域的作用逐漸被人們重視。然而，Ga1-3是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜容受

3、性的改變國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 為進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜容受性的變化與內(nèi)異癥患者不孕之間的關(guān)系，本研究深入系統(tǒng)地研究了子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因Ga1-3在內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)變化及其調(diào)控機(jī)理。通過研究Ga1-3在內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜中的表達(dá)變化、卵巢甾體激素對(duì)該基因表達(dá)的調(diào)節(jié)以及該基因表達(dá)與生育調(diào)節(jié)重要信號(hào)通路之間的關(guān)系，來明確Ga1-3與內(nèi)異癥性不孕癥的關(guān)系，進(jìn)～步探索內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜容受性的改變與內(nèi)異癥患者不孕之間的關(guān)系

4、，為內(nèi)異癥不孕的病因研究和新的診治靶點(diǎn)研究提供重要線索。 第一部分 內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜Galeetin-3的表達(dá)變化探討Gal-3在內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及意義。 材料與方法收集增生晚期和分泌期的EMT患者和正常對(duì)照的人子宮內(nèi)膜標(biāo)本，分別采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)、免疫組化和Western blot檢測內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜及正常對(duì)照中Gal-3 mRNA及蛋白水平的

5、表達(dá)變化，比較其表達(dá)差異。 結(jié)果 EMT患者在位內(nèi)膜及對(duì)照組子宮內(nèi)膜中均可檢測到Gal-3 mRNA的表達(dá)。正常內(nèi)膜和EMT’在位內(nèi)膜組織分泌期Gal-3的mRNA表達(dá)均高于增生期(P<0.001)。與增生晚期和分泌中期正常子宮內(nèi)膜相比，在位內(nèi)膜Gal-3 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.001)。Gal-3蛋白定位于子宮內(nèi)膜的腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。EMT患者在位內(nèi)膜Gal-3蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組，其表達(dá)在分

6、泌期高于增生期。 結(jié)論 內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜Gal-3 mRNA和蛋白表達(dá)降低，可能影響子宮內(nèi)膜容受性從而導(dǎo)致不孕。 目的 第二部 EMT在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)Galeetin-3的體外研究探討 Gal-3在體外培養(yǎng)的EMT患者在位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及意義。 材料與方法 收集人子宮內(nèi)膜，用膠原酶消化法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞純

7、度鑒定。逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westem blot檢測。EMT患者在位內(nèi)膜及正常對(duì)照中Gal-3 mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，比較其表達(dá)差異。 結(jié)果 分離的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)90％以上。無論是正常對(duì)照組還是EMT’組，子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞Gal-3 mRNA表達(dá)均比間質(zhì)細(xì)胞高(P<0.01)。子宮內(nèi)膜腺上皮和子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中Gal-3 mRNA表達(dá)：在對(duì)照組分泌期高于增生期，EMT患者分泌期

8、明顯低于對(duì)照(P<0.01)。EMT分泌期與增生期患者中Gal-3 mRNA表達(dá)分別低于同期對(duì)照組(P<0.05)。EMT組分泌期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，Gal-3蛋白表達(dá)比對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。對(duì)照組和EMT組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞Gal-3蛋白表達(dá)比子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞高(P<0.05)。 結(jié)論 子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞都可以合成、分泌Gal-3。分泌期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞Gal-3 mRNA和蛋白表達(dá)比間質(zhì)細(xì)胞多。EM

9、T患者Gal-3表達(dá)降低。 第三部分雌孕激素對(duì)EMT在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)Galeetin-3的調(diào)控作用 目的探討雌、孕激素對(duì)體外培養(yǎng)的EMT子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中Gal-3表達(dá)的影響。 材料與方法 體外分離培養(yǎng)的EMT和正常人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，平行設(shè)立對(duì)照組和處理組，處理組分別給予不同濃度(10<'-10>M～10<'-6>M)的雌激素(17β-E<,2>)和(10<'-9>M～10<'-5>M)孕激素(

10、MPA)處理24小時(shí)，觀察其對(duì)Gal-3轉(zhuǎn)錄水平的影響。10<'-8>M雌激素、10<'-7>M孕激素和10<'-8>M雌激素+10<'-7>M孕激素聯(lián)合處理，分別作用24、48、72小時(shí)后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Gal-3轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果正常人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞經(jīng)10<'-9>M(2.748±0.378)、10<'-8>M(6.767±0.737)、10<'-7>M(3.732±0.826)、10<'-6>M(2

11、.730±1.023)17β-E<,2>處理后Gal-3表達(dá)增加，與未處理組相比差異有顯著性(P<0.05)。而10<'-10>M(2.193±1.270)E<,2>處理后與未處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10<'-9>M(4.560±0.566)、10<'-8>M(6.597±0.735)、10<'-7>M(10.609±0.335)、10<'-6>M(3.946±0.860)、10<'-5>M(2.263±0.966)

12、MPA處理后Gal-3表達(dá)增加，與未處理組相比差異有顯著性(P<0.01)。正常內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞經(jīng)雌、孕和雌孕聯(lián)合處理不同時(shí)間后，Gal-3表達(dá)上調(diào)順序依次為處理72h>48h>24h>未處理組，與未處理組相比差異有顯著性(P<0.01)。Gal-3的表達(dá)隨處理時(shí)間延長而逐漸增加，呈時(shí)間依賴性。與未處理組相比，Gal-3表達(dá)為孕激素組>雌孕激素聯(lián)合組>雌激素組(P<0.01)。EMT組經(jīng)雌、孕和雌孕激素聯(lián)合處理不同時(shí)間后，Gal-3表達(dá)上

13、調(diào)順序依次為處理24h>48h>72h>未處理組，差異有顯著性(P<0.01)。雌孕激素聯(lián)合處理組、孕激素處理組和雌激素處理組Gal-3的表達(dá)不隨時(shí)間依賴性下降。雌孕激素聯(lián)合組Gal-3表達(dá)高于雌激素組、孕激素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但雌激素處理組與孕激素處理組二者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 雌激素和孕激素能上調(diào)Gal-3的表達(dá)，在正常對(duì)照組其上調(diào)作用呈劑量依賴性。孕激素處理后Gal-

14、3表達(dá)上調(diào)最明顯，雌激素削弱孕激素對(duì)Gal-3表達(dá)的上調(diào)作用。在EMT患者子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中Gal-3表達(dá)隨處理時(shí)間的延長而下降；孕激素處理組Gal-3表達(dá)低于雌孕激素聯(lián)合處理組。EMT患者Gal-3表達(dá)對(duì)孕激素刺激不敏感可能與EMT患者Gal-3表達(dá)水平下降有關(guān)，這可能是導(dǎo)致不孕的重要機(jī)理之一。 第四部分NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)EMT在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá) 目的Galeetin-3的調(diào)控作用研究發(fā)現(xiàn)核因子kappa B

15、(NF-kB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎著床中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在了解Gal-3在人類子宮內(nèi)膜表達(dá)以及其上游調(diào)節(jié)是否與NF-kB信號(hào)通路有關(guān)。 材料與方法 體外分離培養(yǎng)的EMT和正常人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，給予NF-kB抑制劑MG132處理1小時(shí)后，再分別給予正常培液、10<'-8>M雌激素、10<'-7>M孕激素和雌孕激素聯(lián)合處理24小時(shí)后Western blot檢測Gal-3蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)論 Gal-3