膽堿和蛋氨酸對(duì)奶牛圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)平衡和機(jī)體健康的影響及機(jī)制.pdf

1、化，極值多出現(xiàn)于第0和7d，此時(shí)奶牛體脂動(dòng)員最為嚴(yán)重，神經(jīng)內(nèi)分泌顯著改變，肝臟功能和機(jī)體健康均明顯下降。上述結(jié)果表明，圍產(chǎn)期奶牛NEL、MP和MG的負(fù)平衡均出現(xiàn)于圍產(chǎn)后期，但圍產(chǎn)前期奶牛生理代謝參數(shù)、器官功能和機(jī)體健康已發(fā)生改變，可見(jiàn)奶牛圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控應(yīng)從圍產(chǎn)前期開(kāi)始。
　　試驗(yàn)2.過(guò)瘤胃膽堿和過(guò)瘤胃蛋氨酸對(duì)奶牛圍產(chǎn)期能量平衡和健康的影響
　　本試驗(yàn)旨在研究日糧添加RPC（15g/d，以氯化膽堿計(jì)）和RPM（15g/d，以D

2、L-Met計(jì)）對(duì)奶牛圍產(chǎn)期能量平衡和機(jī)體健康的影響，選取48頭健康、經(jīng)產(chǎn)的中國(guó)荷斯坦奶牛，采用2×2因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按配對(duì)設(shè)計(jì)原則分為4組，每組12頭奶牛，分別為對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、基礎(chǔ)日糧+RPC、基礎(chǔ)日糧+RPM和基礎(chǔ)日糧+RPC+RPM。基礎(chǔ)日糧同試驗(yàn)1，干奶后即開(kāi)始預(yù)飼圍產(chǎn)前期日糧，分娩后轉(zhuǎn)入泌乳日糧，試驗(yàn)期為整個(gè)圍產(chǎn)期(-21d至21d)，評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，日糧添加RPC提高了奶牛產(chǎn)后第14d的采食量，RPM對(duì)采食量無(wú)影響

3、，RPC和RPM均可促進(jìn)奶牛圍產(chǎn)后期的能量平衡(EB)，而對(duì)產(chǎn)前EB無(wú)影響;RPC和RPM均可降低血漿NEFA和β-羥基丁酸(BHBA)含量，并提高血漿葡萄糖和極低密度脂蛋白(VLDL)含量;RPC提高了奶牛肝臟活力指數(shù)(LAI)和肝臟功能指數(shù)(LFI)，RPM亦具有提高LFI的趨勢(shì)，RPC和RPM均具有提高修正的定量胰島素敏感檢測(cè)指數(shù)(RQUICKI)的趨勢(shì);日糧添加RPC和RPM提高了血漿總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物

4、酶(GSH-Px)活性和維生素E的含量及外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例(CD4+/CD8+)，并降低了血漿丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。研究表明，日糧添加RPC和RPM可緩解奶牛圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡，改善肝臟功能，促進(jìn)機(jī)體健康。綜合上述和其它評(píng)價(jià)指標(biāo)（詳見(jiàn)第三章），RPC在調(diào)控奶牛圍產(chǎn)期能量平衡方面更有優(yōu)勢(shì)。
　　試驗(yàn)3.過(guò)瘤胃膽堿和過(guò)瘤胃蛋氨酸對(duì)奶牛圍產(chǎn)期蛋白質(zhì)平衡、氨基酸代謝和產(chǎn)后泌乳性

5、能的影響
　　本試驗(yàn)旨在探究RPC和RPM對(duì)奶牛圍產(chǎn)期機(jī)體蛋白質(zhì)平衡、氨基酸代謝和產(chǎn)后泌乳性能的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和奶牛飼養(yǎng)管理均同試驗(yàn)2。研究發(fā)現(xiàn)，RPM具有促進(jìn)奶牛圍產(chǎn)期全期機(jī)體MP平衡的趨勢(shì)，RPC不影響全期MP平衡，但RPC和RPM均具有提高產(chǎn)后第14d MP平衡的趨勢(shì);RPC和RPM均顯著降低了血漿3-甲基組氨酸(3-MH)的含量，RPM還降低了血漿尿素氮(PUN)含量，RPC對(duì)PUN無(wú)影響;RPC和RPM均提高或趨于提高奶

6、牛血漿總氨基酸(TAA)、總必需氨基酸（TEAA）、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)和牛磺酸(Tau)的含量;添加RPC和RPM提高了奶牛泌乳早期4％乳脂校正乳產(chǎn)量(4％FCM，對(duì)照組、RPC組、RPM組和RPC+RPM組分別為22.70、23.42、23.31和23.94kg/d)和乳脂率，RPM可提高乳蛋白率，而RPC對(duì)乳蛋白的影響不顯著，僅在數(shù)值上有所提高;RPM提高了乳中組氨酸(His)含量，并具有提高M(jìn)et含量的趨勢(shì)，RPC

7、具有提高乳中His含量的趨勢(shì)，但不影響Met含量。以上結(jié)果表明，日糧添加RPC和RPM可減少機(jī)體蛋白質(zhì)動(dòng)員，促進(jìn)蛋白質(zhì)平衡，并調(diào)控機(jī)體氨基酸代謝，提高
　　營(yíng)養(yǎng)素負(fù)平衡是奶牛圍產(chǎn)期（產(chǎn)前21d-產(chǎn)后21d）的典型生理特征，為滿足機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需要，奶牛大量動(dòng)員體組織的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其它營(yíng)養(yǎng)素。機(jī)體營(yíng)養(yǎng)素的大量動(dòng)員易造成一系列代謝性疾病，如酮病和脂肪肝，并誘發(fā)肝臟和其它器官的氧化應(yīng)激及免疫抑制，降低肝臟功能和機(jī)體健康。膽堿和蛋氨酸(Met

8、)因其在奶牛肝臟一碳單位循環(huán)、脂質(zhì)氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)及機(jī)體健康方面的益生功效，已受到關(guān)注。目前，現(xiàn)有研究仍存不足:(1)奶牛圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)平衡和營(yíng)養(yǎng)生理的變化規(guī)律尚未完全理清，評(píng)價(jià)指標(biāo)不系統(tǒng)不準(zhǔn)確;(2)添加過(guò)瘤胃膽堿(RPC)和過(guò)瘤胃蛋氨酸（RPM）時(shí)，不考慮基礎(chǔ)日糧蛋白質(zhì)含量，且研究深度不夠，缺乏多指標(biāo)、多層次的系統(tǒng)性探究;(3)膽堿和蛋氨酸調(diào)控肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝的信號(hào)通路尚不明確?；谝陨蠁?wèn)題，本研究在評(píng)價(jià)圍產(chǎn)期奶牛機(jī)體營(yíng)養(yǎng)平衡和生理參數(shù)的

9、動(dòng)態(tài)變化（試驗(yàn)1）的基礎(chǔ)上，從能量代謝和機(jī)體健康(試驗(yàn)2)、蛋白質(zhì)平衡和產(chǎn)后泌乳性能（試驗(yàn)3）及新生犢牛體尺參數(shù)和營(yíng)養(yǎng)生理（試驗(yàn)4）多個(gè)方面，綜合研究RPC和RPM對(duì)奶牛圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控，并以非酯化脂肪酸(NEFA)刺激構(gòu)建LO2肝細(xì)胞模型（試驗(yàn)5），探究膽堿和蛋氨酸調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)和能量代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子（試驗(yàn)6），為RPC和RPM在圍產(chǎn)期奶牛上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。
　　試驗(yàn)1.奶牛圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)平衡的評(píng)估及血

10、液代謝參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化
　　為明確奶牛圍產(chǎn)期機(jī)體營(yíng)養(yǎng)平衡和營(yíng)養(yǎng)生理參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)試驗(yàn)和營(yíng)養(yǎng)實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料，本試驗(yàn)選取14頭健康經(jīng)產(chǎn)的中國(guó)荷斯坦奶牛，整個(gè)干奶期采食同一日糧（1.51Mcal/kg NEL和11.92％CP，干物質(zhì)基礎(chǔ)，下同），分娩后轉(zhuǎn)入泌乳日糧(1.69Mcal/kg NEL和15.02％CP)。日糧瘤胃可降解淀粉(RDS)分別為20.17％和18.06％，物理有效中性洗滌纖維(peNDF)分別為peNDF

11、1.18=28.71％和24.24％及peNDF8.0=18.58％和16.60％，因此日糧碳水化合物平衡指數(shù)(CBI=peNDF/RDS)分別為CBI1.18=1.42和1.34及CBI8.0=0.92和0.92。干奶前期為日糧適應(yīng)期，正試期為整個(gè)圍產(chǎn)期，即干奶后期（圍產(chǎn)前期）和泌乳早期（圍產(chǎn)后期），共42d，每天或每周采集相關(guān)樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析、計(jì)算和模型預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)前期奶牛機(jī)體泌乳凈能(NEL)、代謝蛋白質(zhì)(MP)和代謝

12、葡萄糖(MG)均不存在負(fù)平衡，而分娩后均出現(xiàn)負(fù)平衡，且產(chǎn)后第7d負(fù)平衡最為嚴(yán)重，NEL、MP和MG的缺乏量分別為5.76Mcal/d、254.42g/d和387.54g/d;隨分娩的臨近，奶牛DM、NEL、MP和MG攝入量均下降，分娩當(dāng)天(0d)達(dá)到最低，較第-21d分別下降39.27％、39.30％、39.45％和32.82％，分娩后逐漸回升;從-21d到21d，奶牛血液生理代謝參數(shù)和相關(guān)綜合指數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的二次益線變產(chǎn)后泌乳性能

13、，且RPM對(duì)奶牛氨基酸代謝的調(diào)控效應(yīng)優(yōu)于RPC。
　　試驗(yàn)4.圍產(chǎn)前期添加過(guò)瘤胃膽堿和蛋氨酸對(duì)新生犢牛體尺指標(biāo)和血液參數(shù)的影響
　　為確定圍產(chǎn)前期奶牛日糧添加RPC和RPM對(duì)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)生理和機(jī)體健康的影響，在試驗(yàn)2和3的基礎(chǔ)上，檢測(cè)新生犢牛體尺重及血液理代謝、肝臟新生犢牛體尺重及血液理代謝、肝臟功能、抗氧化和免疫狀態(tài)等指標(biāo)。圍產(chǎn)前期試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理均同試驗(yàn)2，犢牛出生后立即稱量體重，測(cè)量體尺，頸靜脈采血，測(cè)定相關(guān)指

14、標(biāo)。結(jié)果表明，除RPC增加尻寬，以及RPM增加腰角寬外，RPC和RPM對(duì)犢牛初生重和其它體尺指標(biāo)、指數(shù)均無(wú)影響;RPC具有提高新生犢牛血糖的趨勢(shì)，RPM則具有提高PUN的趨勢(shì)，而血漿NEFA、BHBA、VLDL和3-MH含量均無(wú)顯著變化;RPM提高了新生犢牛血漿Met和半胱氨酸(Cys)濃度，并具有提高Tau濃度的趨勢(shì);RPC亦趨于提高血漿Met和Cys濃度，但不影響Tau濃度;RPC和RPM均提高或趨于提高血漿胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IG

15、F-1)含量，但對(duì)其它內(nèi)分泌指標(biāo)均無(wú)影響;RPC降低了血漿TNF-α含量，并具有提高血漿T-AOC和外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的趨勢(shì);RPM具有提高血漿T-AOC和降低TNF-α的趨勢(shì)，但對(duì)CD4+/CD8+無(wú)影響。可見(jiàn)，RPC和RPM可不同程度影響新生犢牛蛋白質(zhì)和氨基酸代謝，提高血漿部分氨基酸及葡萄糖和IGF-1含量，并改善機(jī)體抗氧化和免疫功能，這些變化對(duì)犢牛生長(zhǎng)發(fā)育的后續(xù)影響有待進(jìn)一步研究。
　　試驗(yàn)5.NEFA和BH

16、BA對(duì)肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響
　　本試驗(yàn)以LO2肝細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，研究BHBA和NEFA對(duì)肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，在此基礎(chǔ)上，為后續(xù)研究建立細(xì)胞模型。首先，設(shè)計(jì)不同濃度梯度，BHBA和NEFA的梯度均為0、0.5、1.0、1.5、2.0和4.0mmol/L，每濃度6重復(fù)，細(xì)胞處理時(shí)間均為24h，以細(xì)胞增殖、氧化還原參數(shù)及腺苷一磷酸激活的蛋白激酶α(AMPKα)和TNF-α的表達(dá)量為評(píng)

17、價(jià)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨BHBA和NEFA濃度的升高，細(xì)胞增殖、抗氧化能力和AMPKα表達(dá)量逐漸降低，TNF-α表達(dá)量逐漸升高;根據(jù)研究需求綜合考量，最終確定BHBA和NEFA后續(xù)試驗(yàn)濃度均為1.5mmol/L。其次，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為對(duì)照組、BHBA組、NEFA組和混合添加組，每組6個(gè)重復(fù)，處理時(shí)間為24h，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，研究表明，BHBA和NEFA均不同程度影響AMPKα、肝臟X受體α(LXRα)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α（PPA

18、Rα）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）等調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞脂肪酸氧化、合成和轉(zhuǎn)運(yùn)等靶基因的表達(dá);BHBA和NEFA均抑制肝細(xì)胞紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nrf2)抗氧化通路，并激活核因子κB(NF-κB)炎癥通路。研究表明，較高濃度(1.5mmol/L)的BHBA和NEFA均可抑制肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝，并降低抗氧化能力，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。NEFA1.5mmol/L可用于構(gòu)建肝細(xì)胞模型，以模擬體脂動(dòng)員時(shí)肝細(xì)胞的

19、生存環(huán)境。
　　試驗(yàn)6.膽堿和蛋氨酸對(duì)NEFA肝細(xì)胞模型能量和脂質(zhì)代謝的調(diào)控
　　在前期動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)旨在研究膽堿（氯化膽堿，下同）和Met對(duì)NEFA肝細(xì)胞模型能量和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)的影響，并確證AMPKα信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用。為精準(zhǔn)控制培養(yǎng)基中膽堿和蛋氨酸含量，本試驗(yàn)采用無(wú)膽堿無(wú)蛋氨酸的定制培養(yǎng)基，施加處理前，細(xì)胞在無(wú)血清的定制培養(yǎng)基中饑餓6h。經(jīng)篩選，膽堿和Met的適宜濃度分別為50和3

20、00μmol/L，設(shè)空白對(duì)照組(無(wú)膽堿無(wú)Met)、膽堿組（50μmol/L）、Met組（300μmol/L）和混合添加組(50μmol/L膽堿+300μmol/LMet);后續(xù)試驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中加入AMPKα抑制劑BML-275(10μmol/L)，每個(gè)處理均設(shè)6個(gè)重復(fù)，處理時(shí)間24h，測(cè)定相關(guān)生化指標(biāo)及基因和蛋白的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿和Met可提高AMPKα蛋白的磷酸化水平(p-AMPKα/AMPKα)，提高PPARα基因和蛋白的表

21、達(dá)量，降低LXRα和SREBP-1c基因和蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而改變下游靶基因的表達(dá)量，促進(jìn)脂肪酸氧化和載脂蛋白合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，抑制脂肪酸和酮體生成相關(guān)基因的表達(dá);膽堿和Met均可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，激活Nrf2抗氧化通路，降低TNF-α基因和蛋白的表達(dá)量;當(dāng)加入BML-275時(shí)，肝細(xì)胞p-AMPKα/AMPKα顯著下降，此時(shí)膽堿和Met對(duì)肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子及其靶基因的調(diào)控效應(yīng)明顯下降。以上結(jié)果表明，膽堿和Met可通過(guò)調(diào)控

22、AMPKα通路及一些調(diào)節(jié)因子(LXRα、PPARα和SREBP-1c)的表達(dá)，調(diào)控肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝，促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪酸氧化和載脂蛋白合成，抑制脂肪酸合成和酮體產(chǎn)生。此外，膽堿和Met還可改善肝細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，減少氧化和炎性損傷。
　　本研究表明，膽堿和Met可通過(guò)激活肝細(xì)胞AMPKα信號(hào)通路和調(diào)節(jié)LXRα、PPARα和SREBP-1c等因子的表達(dá)，調(diào)控肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)蓄積，并通過(guò)Nrf2和NF-κB通路降低NEF