不同補片對體外培養(yǎng)人胎肺成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成功能的影響.pdf

1、腹外疝是臨床上的常見病和多發(fā)病，隨著外科材料學(xué)的發(fā)展，無張力疝修補術(shù)日益增多，現(xiàn)已成為外科臨床的常規(guī)技術(shù)，補片質(zhì)量也成為影響手術(shù)復(fù)發(fā)率及并發(fā)癥發(fā)生率的重要因素之一。 就補片品質(zhì)而言，其主要影響因素有兩個方面，1：補片的生物相容性，2：補片對體內(nèi)成纖維細(xì)胞膠原合成的影響。對于前者，補片的生產(chǎn)廠家都已做了大量詳實的相關(guān)研究，有許多資料可供參考，而后者我們可以獲得的資料甚少。為此，本研究就臨床上最常用的三種不材質(zhì)的補片，進行體外實驗研

2、究，希望能獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，以期為疝外科臨床提供有益的幫助。 研究目的： 1、觀察不同材質(zhì)的補片在體外同一條件下對人成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡的影響。 2、觀察不同材質(zhì)的補片在體外同一條件下對人成纖維細(xì)胞膠原合成的影響。 實驗方法： 1、實驗分組 本研究分4組及正常對照組、聚丙烯組(PP組)、聚酯組(PE組)和膨化聚四氟乙烯組(ePTFE組)。正常對照組為在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中不加入補片，三個實驗組

3、分別加入聚丙烯補片(PP組)、膨化聚四氟乙烯補片(ePTFE組)和聚酯補片(PE組)。其他培養(yǎng)條件完全相同。 2、觀察指標(biāo)及方法 2.1人成纖維細(xì)胞(HFL1)的培養(yǎng)和傳代 按照American Type Culture Collection(ATCC)要求，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(包含青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL)于37℃在含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天傳代，取第四代增殖狀態(tài)良

4、好的細(xì)胞實驗。 2.2細(xì)胞增殖實驗(MTT法) 將貼壁培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1×105/ml，接種于24孔板，每孔0.5ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，最終改用無血清DMEM培養(yǎng)基進行實驗，并分別加入大小為1.0cm×1.0cm的三種補片，在補片上壓以長1.0cm，直徑2mm的鈦絲以防止補片浮起，繼續(xù)培養(yǎng)48小時直接加入100ulM

5、TT試劑，37℃孵育4小時，吸出800ul培養(yǎng)基，每孔加入500ul二甲基亞砜，于室溫下震蕩15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在492nm處測量各孔的吸光度。細(xì)胞增殖情況用各孔的吸光度表示。 2.3細(xì)胞周期測定(流式細(xì)胞術(shù)法)： 以S期細(xì)胞指數(shù)(SPF)及凋亡細(xì)胞比例觀察各補片對細(xì)胞周期的影響。 首先將人成纖維細(xì)胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1×105/ml，接種子12孔板，每孔1ml，

6、依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，然后改用無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別加入大小為1.5cm×1.5cm的三種補片，在補片上壓以長1.5cm直徑2mm的鈦絲以防止補片浮起，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，以0.05％胰酶消化細(xì)胞、血清中和后收集細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，并用PBS洗滌離心三次，最后一次離心后棄去大部分PBS，僅保留約0.5ml，加入70％冷乙醇2ml固定，4℃過夜后，離心棄去乙醇，PBS洗滌，10

7、00rpm離心10分鐘，RNase A(0.5mg/ml)37℃消化30分鐘，PI(50mg/ml)染色，室溫避光30分鐘，上機檢測，設(shè)定激發(fā)光波長為488nm．細(xì)胞增殖情況由S期細(xì)胞指數(shù)(SPF)表示，S期指數(shù)(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100％．細(xì)胞凋亡情況由凋亡細(xì)胞百分比表示，為凋亡細(xì)胞的數(shù)量/總的計數(shù)細(xì)胞的數(shù)量。 2.4人成纖維細(xì)胞膠原合成功能的檢測(羥脯氨酸測定法)：膠原蛋白總量以羥脯氨酸濃度表示，檢

8、測采用消化法，嚴(yán)格按照羥脯氨酸測定試劑盒的要求進行操作，其過程簡述如下。將人成纖維細(xì)胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1x105/ml，接種于12孔板，每孔1ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，然后改用無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別加入大小為1.5cmx1.5cm的三種補片，在補片上壓以長1.5cm直徑2mm的鈦絲防止補片浮起。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)48小時。吸去上清，PBS洗滌，胰

9、酶充分消化、中和、吹打，收集細(xì)胞，并使用PBS洗滌各孔三次，收集洗滌液，將上述液體，于3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，并加入純水1000ul，初步破碎細(xì)胞，然后用超聲細(xì)胞破碎儀充分破碎，上述破碎后的液體，于3500轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清0.5ml，以純水為空白管、2ug/ml的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液為標(biāo)準(zhǔn)管，用751紫外分光光度計于550nm測定各管吸光度，并算出羥脯氨酸濃度。計算公式，羥脯氨酸濃度=((測定管吸光度—空白管吸光度)/

10、(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度—空白管吸光度))×2.0。 3、統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件，就上述觀察指標(biāo)進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計方法使用成組設(shè)計的方差分析(One—Way ANOVA)，組間比較，方差齊性檢驗，方差齊則使用S—N—K法，方差不齊時使用Dennett's T3法。所有的顯著性水平(P值)均為0.05。 結(jié)果： 1、細(xì)胞增殖實驗(MTT法)：正常對照組較三個補片組的吸光度為高，差異

11、存在顯著性(P<0.05)。表明三種補片對成纖維細(xì)胞增殖均有影響，PP組較PE組為高，差異有顯著性(P<0.05)，ePTFE組與PE組、PP組之間差異無顯著性(P>0.05)。 2、人成纖維細(xì)胞S期指數(shù)(SPF)：組間兩兩比較PE組、ePTFE組較PP組、正常對照組S期細(xì)胞指數(shù)為高，其差異存在顯著性(P<0.05)。PE組和ePTFE組之間差異并無顯著性(P=0.053)，聚丙烯補片組、正常對照組之間差異也無顯著性(P＝0.2

12、7)。 3、凋亡細(xì)胞比例：經(jīng)統(tǒng)計分析，本研究的細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)組間方差不齊，故組間比較使用Dennett's T3法，PE、ePTFE組較PP片組、正常對照組的凋亡細(xì)胞比例為高，其差異存在顯著性(P<0.05)。PE組和ePTFE組之間差異無顯著性(P>0.05)，PP組、正常對照組之間差異無顯著性(P>0.05)。 4、細(xì)胞膠原蛋白合成水平：正常對照組羥脯氨酸濃度最高，為1.70±0.15；其次為PP組，為1.61±0.1

13、8；PE組再次，ePTFE組最低。但是，正常對照組和PP組之間差異無顯著性(P=0.184)；正常對照組較PE組及ePTFE組高，差異有顯著性(P<0.05)；PE組和ePTFE組之間差異無顯著性(P>0.05)。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)： 1：三種不同材質(zhì)的補片對體外培養(yǎng)條件下的人成纖維細(xì)胞的增殖均有一定的影響。 2：單股編制的聚丙烯網(wǎng)片，對體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞無論是增殖、凋亡成還是膠原蛋白合的影響均較小