鈣蛋白酶在高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制中的作用.pdf

1、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科常見(jiàn)的病理過(guò)程以及致盲的主要原因。已有眾多研究證實(shí)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡且伴有視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高。鈣蛋白酶(calpains)是一種全身廣泛存在的中性限制性鈣蛋白水解酶。在病理狀態(tài)下，異常增高的Ca2+濃度可激活calpains，引起疾病的發(fā)生。E-64d是一種具有細(xì)胞膜高通透性的、與calpains的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)高度選擇性結(jié)合的calpains抑制劑，已被證實(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有較好的抗蛋白

2、水解作用。 本研究從形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、蛋白質(zhì)水平和分子水平四個(gè)層次研究了急性高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血再灌注后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮水腫和壞死程度、細(xì)胞凋亡、calpains的蛋白表達(dá)和mRNA的改變，以及calpains抑制劑E-64d對(duì)上述改變的抑制作用，探討了以急性高眼壓動(dòng)物模型研究視網(wǎng)膜缺血再灌注發(fā)病機(jī)制的可行性，calpains在其發(fā)生機(jī)制中的作用及機(jī)理，以及E-64d對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注的預(yù)防作用。 第一部分急性高眼

3、壓性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的建立 目的： 本研究將急性高眼壓誘發(fā)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?lái)研究急性高眼壓對(duì)視網(wǎng)膜的水腫、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變以及視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，探討將急性高眼壓誘發(fā)的缺血再灌注損傷作為動(dòng)物模型研究其發(fā)病機(jī)制的可行性。 方法： 采用清潔級(jí)200～300g SD大鼠。將連接生理鹽水輸液管的20號(hào)留置針刺入大鼠前房，然后升高升高輸液瓶形成109.7 mmHg的眼壓，持續(xù)1

4、h后降低輸液瓶高度至動(dòng)物水平，拔出前房灌注針頭，可見(jiàn)眼結(jié)膜充血，恢復(fù)血液供應(yīng)，缺血再灌注后1、3、6、24、72 h處死動(dòng)物，摘除眼球。標(biāo)本常規(guī)10％中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后置光鏡下觀察。Bax和m-calpain蛋白表達(dá)測(cè)定采用免疫組化方法。 結(jié)果： SD大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后1～24h，光鏡可見(jiàn)視網(wǎng)膜明顯水腫，神經(jīng)元細(xì)胞胞體及線粒體腫脹，細(xì)胞膜崩解，核染色體不規(guī)則分布，細(xì)胞壞死。細(xì)胞壞死最早見(jiàn)于再

5、灌注1h后，72小時(shí)視網(wǎng)膜變薄。在細(xì)胞壞死的同時(shí)可見(jiàn)凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bax在急性高眼壓導(dǎo)致缺血的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。隨著再灌注作用時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣蛋白酶m-calpain陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸增多。 結(jié)論： 本研究證實(shí)了急性急性高眼壓確可誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡，視網(wǎng)膜萎縮變薄，在細(xì)胞壞死的同時(shí)可見(jiàn)凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bax以及鈣蛋白酶m-calpain表達(dá)上升，將急性急性高眼壓性模型作為動(dòng)物模型研究

6、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中有一定可行性。 第二部分：急性高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的凋亡及鈣蛋白酶表達(dá) 目的： 探討caspase-3、m-calpain、calpastatin蛋白相關(guān)的細(xì)胞凋亡、以及鈣蛋白酶在急性高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的發(fā)生機(jī)制中的作用。 方法： 用急性高眼壓誘發(fā)大鼠發(fā)生視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，用western-blot的方法研究m-calpain蛋白、

7、caspase-3的表達(dá)，用RT-PCR法測(cè)定calpains、calpastatin的mRNA的改變，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。 結(jié)果： SD大鼠在視網(wǎng)膜缺血再灌注前均有m-calpain和caspase-3蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。缺血再灌注后24 h m-calpain和caspase-3的表達(dá)均較正常組上升，視網(wǎng)膜缺血再灌注后m-calpain/calpastatin的比值在6 h后增加，24 h達(dá)到最高峰，72 h后開(kāi)始回落。

8、 結(jié)論： 急性高眼壓誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡，m-calpain和caspase-3的表達(dá)上升，缺血損傷導(dǎo)致calpain/calpastatin的比例上升。 第三部分：鈣蛋白酶抑制劑E-64d對(duì)急性高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷預(yù)防作用 目的： 探討E-64d(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)中對(duì)calpain和caspase-3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

9、 方法： 將SD大鼠隨機(jī)分為視網(wǎng)膜缺血再灌注組，E-64d治療組和正常組。通過(guò)前房穿刺加壓法制成視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)動(dòng)物模型，缺血再灌注分為1、3、6、24、72小時(shí)5個(gè)時(shí)間段。采用Western-blot以及RT-PCR方法測(cè)定在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的calpian蛋白和mRNA表達(dá)情況以及caspase-3的蛋白表達(dá)改變。 結(jié)果： 缺血再灌注后24小時(shí)m-calpain、caspase-3

10、蛋白的表達(dá)均較正常組上升，而玻璃體腔注射E-64d組m-calpain、caspase-3蛋白表達(dá)與正常組相似，比缺血再灌注組下降。視網(wǎng)膜缺血再灌注后m-calpain/calpastatin mRNA的比值在6小時(shí)后上升，24小時(shí)達(dá)到最高峰，72小時(shí)后開(kāi)始回落，其中缺血再灌注組6小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)與正常組比較P值均小于0.05，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E-64d組與視網(wǎng)膜缺血再灌注24小時(shí)組比較，P值小于0.05，其差異也有顯著

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是三組的m-calpain和calpastatin mRNA轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度差異均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： E-64d作用后較缺血再灌注同一時(shí)間段的視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，水腫減輕，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞m-calpain蛋白陽(yáng)性率明顯下降。E-64d能降低視網(wǎng)膜缺血再灌注時(shí)m-calpain、caspase-3蛋白的表達(dá)，調(diào)控m-calpain/calpastatin的mRNA比值?？赡軐?duì)視網(wǎng)膜的缺血