Pin1調(diào)控DNA損傷反應(yīng)中p53穩(wěn)定性和腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力的機(jī)制研究.pdf

1、在腫瘤治療中，應(yīng)用電離輻射和腫瘤化療藥物等DNA損傷劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的主要策略。野生型p53是DNA損傷后細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中決定細(xì)胞生死命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)控因子。DNA損傷反應(yīng)引發(fā)p53發(fā)生磷酸化等一系列化學(xué)修飾，從而使得p53穩(wěn)定性增強(qiáng)并累積，轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游基因表達(dá)。 DNA損傷反應(yīng)中p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性的升高精密地依靠多個(gè)位于脯氨酸前的絲、蘇氨酸殘基的磷酸化。研究進(jìn)展表明，那些被磷酸化修飾的Ser-/Thr-Pro基

2、序還受到肽基—脯氨酰順/反異構(gòu)酶即Pinl的調(diào)控。Pinl特異催化肽-脯氨酰間肽鍵發(fā)生順?lè)串悩?gòu)化，誘導(dǎo)底物發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而調(diào)控其化學(xué)修飾、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及與其它蛋白的相互作用。 先前基于正常細(xì)胞的研究表明，在電離輻射、紫外照射等引發(fā)的DNA損傷反應(yīng)中，Pinl與磷酸化的p53結(jié)合并調(diào)控增強(qiáng)p53的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激活能力。然而其細(xì)胞學(xué)后果卻還存在存在著相互矛盾的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，表現(xiàn)為：一方面Pinl通過(guò)維持細(xì)胞周期檢查點(diǎn)機(jī)制避免細(xì)

3、胞凋亡，另一方面Pinl通過(guò)增強(qiáng)促凋亡基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。對(duì)于腫瘤細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中Pinl如何調(diào)控p53的穩(wěn)定性和凋亡誘導(dǎo)功能目前還不清楚。這是因?yàn)镻inl在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“催化劑”。Pinl的這種功能與p53的腫瘤抑制作用相互拮抗。已有報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中p53被癌基因類(lèi)激酶修飾后產(chǎn)生pSer-Thr-Pro基序，正是Pinl結(jié)合所需位點(diǎn)。那么腫瘤細(xì)胞非應(yīng)激狀態(tài)下Pinl與p53是否

4、存在相互作用?Pinl是否對(duì)p53起負(fù)調(diào)控作用?由于泛素化E3-連接酶Mdm2是p53的主要負(fù)調(diào)控分子，它介導(dǎo)p53經(jīng)由泛素化蛋白酶體途徑降解。那么，在腫瘤細(xì)胞中Pinl是否通過(guò)促進(jìn)Mdm2對(duì)p53的降解而對(duì)p53發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用?在腫瘤細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中，p53分子中可能產(chǎn)生多個(gè)滿(mǎn)足Pinl結(jié)合所需的磷酸化Ser-/Thr-Pro基序，Pinl是否通過(guò)與之結(jié)合并調(diào)控p53構(gòu)象，進(jìn)而抑制p53-Mdm2相互作用，增強(qiáng)p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激

5、活能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡?Pinl對(duì)不同DNA損傷劑順鉑、電離輻射以及阿霉素等誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡反應(yīng)有何影響? 本研究針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探索，并取得了以下研究進(jìn)展： 1．選用Pinl過(guò)表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，采用載體介導(dǎo)的RNA干涉技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定抑制Pinl表達(dá)的MCF-7細(xì)胞模型，為在腫瘤細(xì)胞中開(kāi)展Pinl功能研究打下了良好基礎(chǔ)。 2．利用該模型研究發(fā)現(xiàn)：在非應(yīng)激條件下Pinl可通過(guò)促進(jìn)p53與MDM2結(jié)

6、合降低p53穩(wěn)定性，對(duì)p53發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。Western blot和RT-PCR-檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Pinlknockdown導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)水平升高，而mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。說(shuō)明Pinl對(duì)p53表達(dá)水平的調(diào)控是蛋白水平而不是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。免疫熒光顯示Pinl與p53在MCF．7細(xì)胞中能夠共定位，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明非應(yīng)激條件下MCF-7細(xì)胞中p53的Ser315(-Pro316)位存在磷酸化修飾，并且Pinl與p53存在相互作用。研究還

7、發(fā)現(xiàn)，Pinl knockdown導(dǎo)致p53與MDM2結(jié)合減少，因此部分增強(qiáng)了p53穩(wěn)定性。上述結(jié)果說(shuō)明在非應(yīng)激條件下Pinl與p53結(jié)合后通過(guò)改變其構(gòu)象，促進(jìn)了p53與具有E3連接酶功能的MDM2結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)其對(duì)p53的泛素化降解，降低了p53穩(wěn)定性。 3．在研究順鉑處理引發(fā)的DNA損傷反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)：Pinl是順鉑所致DNA損傷反應(yīng)中抑制Mdm2與p53結(jié)合及其介導(dǎo)的泛素化降解，增強(qiáng)p53穩(wěn)定性的重要正調(diào)因子。Pinl kno

8、ckdown導(dǎo)致p53蛋白穩(wěn)定性受到顯著損害，累積降低。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，順鉑處理12h顯著地抑制Mdm2與p53的結(jié)合，導(dǎo)致p53累積增加；而Pinl knockdown細(xì)胞中Mdm2與p53的結(jié)合量明顯高于對(duì)照細(xì)胞，p53累積則顯著降低，表明Pinl在DNA損傷反應(yīng)中通過(guò)抑制p53與Mdm2的相互作用，促進(jìn)增強(qiáng)p53穩(wěn)定性和累積，發(fā)揮重要的正調(diào)控作用。電離輻射處理得到了類(lèi)似的結(jié)果。 4．用p53下游靶基因p21<'WAF/

9、<'cipl>啟動(dòng)子構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)揭示，Pinlknockdown導(dǎo)致p53的轉(zhuǎn)錄激活能力顯著降低。干涉Pinl后，p53轉(zhuǎn)錄激活能力降低了60％左右。同時(shí)進(jìn)行外源p53過(guò)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證明，即使在p53表達(dá)水平很高的情況下，當(dāng)Pinl knockdown時(shí)，p53的轉(zhuǎn)錄激活能力仍然很低，可能的原因是，Pinl knockdown時(shí)高表達(dá)水平的p53并不能有效地與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，因此轉(zhuǎn)錄激活靶基因的能力顯著下降，說(shuō)明P

10、inl可能主要是通過(guò)促進(jìn)p53與下游靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄激活能力。在順鉑以及電離輻射處理后對(duì)內(nèi)源性p53下游基因表達(dá)的檢測(cè)同樣證明了，Pinl knockdown導(dǎo)致p53轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期抑制基因p21<'WAF.cipl>和促凋亡基因Bax的能力受到顯著損害。 5．利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Pinl knockdown對(duì)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)，Pinl干涉導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞S期阻滯明顯降低，表

11、明p53激活DNA復(fù)制檢查點(diǎn)的能力受到損害，這與干涉Pinl后p21/表達(dá)水平顯著下降的結(jié)果相一致。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Pinl干涉細(xì)胞經(jīng)順鉑處理誘發(fā)的細(xì)胞凋亡減少約50％，表明Pinl干涉嚴(yán)重抑制順鉑誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡，這與促凋亡基因Bax表達(dá)下降相一致。 6．為了考察Pinl在不同DNA損傷劑處理?xiàng)l件下的作用，檢測(cè)了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ類(lèi)化療藥物阿霉素處理后p53表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，與順鉑、電離輻射處理后的變化

12、不同，與對(duì)照細(xì)胞比較Pinl干涉細(xì)胞p53表達(dá)水平明顯升高，p53下游抗凋亡基因Survivin的表達(dá)下降。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)死細(xì)胞顯示，Pinl干涉細(xì)胞死亡率增高10％，Giema染色顯示凋亡核顯著增加。上述結(jié)果表明，在阿霉素處理中Pinl調(diào)控p53穩(wěn)定性及功能活化的機(jī)制與順鉑、電離輻射處理時(shí)不同，Pinl knockdown對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡有一定的增敏作用，可能與 Pinl knockdown后凋亡誘導(dǎo)基因p53表達(dá)升高，抗凋

13、亡蛋白Survivin表達(dá)下降有關(guān)，其詳細(xì)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。 7．研究進(jìn)展揭示：由于p53．Survivin通路是DNA損傷劑阿霉素等有別于順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一條基本通路，抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)受到p53轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控，而Pinl knockdown后p53表達(dá)水平增高，因此檢測(cè)了Pinl干涉前后Survivin表達(dá)的變化。結(jié)果表明，Pinl干涉后Survivin mRNA表達(dá)水平?jīng)]有變化，而蛋、白表達(dá)水平顯

14、著降低，半衰期縮短，說(shuō)明Pinl干涉后Survivin蛋白表達(dá)水平降低不是由于p53轉(zhuǎn)錄抑制Survivin基因表達(dá)引起的，而是Pinl干涉降低Survivin穩(wěn)定性的結(jié)果。Pinl干涉后導(dǎo)致抗凋亡蛋白Survivin表達(dá)降低可能是Pinl干涉對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡起增敏作用的原因之一。這一結(jié)果也提示Pinl可能通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡蛋白Survivin的穩(wěn)定性來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。 綜上，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞中Pinl的功能研

15、究發(fā)現(xiàn)：一方面，Pinl在順鉑引發(fā)的DNA損傷反應(yīng)中通過(guò)抑制具有E3連接酶功能的Mdm2與p53的結(jié)合及其介導(dǎo)的泛素化降解，增強(qiáng)p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激活下游凋亡相關(guān)基因的能力，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。另一方面，在腫瘤細(xì)胞非應(yīng)激狀態(tài)下Pinl又參與促進(jìn)Mdm2與p53的結(jié)合及其介導(dǎo)的p53泛素化降解，對(duì)p53穩(wěn)定性發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。此外，干涉Pinl對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡具有一定的增敏作用，其可能的機(jī)制是，干涉Pinl提高凋亡誘導(dǎo)蛋白