大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化的心肌樣細胞與心肌成纖維細胞移植治療功能性室壁瘤的研究.pdf

1、一﹑研究背景及目的
　　室壁瘤是心肌梗死的嚴重并發(fā)癥之一，是由于心肌細胞壞死和膠原纖維受損，室壁無法抵抗心室收縮時的強大張力，從而向外膨出造成的，其主要并發(fā)癥為附壁血栓、室性心律失常、頑固性充血性心力衰竭和心臟破裂等。室壁瘤在心肌梗死患者中的發(fā)生率高達10％～38％。未治療患者5年存活率為47％[1-3]，10年存活率僅為18％。目前對室壁瘤的主要治療手段是外科手術(shù)，但其僅適于晚期解剖性室壁瘤，對于功能性室壁瘤雖可利用藥物治療改善

2、心功能和防治并發(fā)癥，但不能挽救已受損壞死心肌。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)由于具有取材方便，無免疫排斥性，增殖能力強，多向分化潛能等優(yōu)勢，而成為修復(fù)和重建心肌的研究熱點。應(yīng)用BMMSCs治療心肌梗死、缺血性心臟病等初見成效，顯示了廣闊的臨床治療前景。而應(yīng)用干細胞移植治療功能性室壁瘤是否具有可行性，是否能夠促進室壁瘤的修復(fù)，改善心功能，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。
　　本研究旨在通過觀察移植BMMSCs分化的心肌樣細胞和心

3、肌成纖維細胞(CFs)對大鼠功能性室壁瘤的修復(fù)作用和心功能的影響，為臨床應(yīng)用細胞移植治療功能性室壁瘤提供研究依據(jù)。
　　二﹑研究方法
　　1.BMMSCs的培養(yǎng)、誘導及誘導后鑒定：依據(jù)密度梯度離心法體外分離、培養(yǎng)大鼠BMMSCs，待細胞傳至3代，加入終濃度為10μmol/L的5-氮雜胞苷(5-aza)培養(yǎng)24h后，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，4w后細胞用肌鈣蛋白I(cTnI)鑒定。
　　CFs的培養(yǎng)及鑒定：采用酶消化法和差速貼壁法結(jié)

4、合的方法，培養(yǎng)乳鼠CFs，并用I型膠原蛋白鑒定。
　　2.制備動物模型：結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支，結(jié)扎后左室室壁變蒼白，心電監(jiān)護可見R波振幅升高，表明結(jié)扎成功；4w后，超聲心動圖可見左室收縮和舒張末期內(nèi)徑(LVESD、LVEDD)增大，短軸縮短率(FS)及射血分數(shù)(EF)均降低。前間隔和前壁局部變薄，回聲增強，收縮功能均不同程度減弱或消失。室壁瘤部位表現(xiàn)為前壁及心尖部有隆起結(jié)構(gòu)，并和心室壁有連續(xù)性。
　　3.分組：造模成功大鼠

5、隨機分為4組(n=10)。①對照組，注射生理鹽水(100μL)；②ClCs組，移植心肌樣細胞(4×106～5×106/100μL)；③CFs組，移植CFs(4×106～5×106/100μL)；④Comb組，移植心肌樣細胞和CFs(4×106～5×106/100μL，1：1混合)。移植前，分別用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)標記心肌樣細胞和CFs，隨后通過開胸直視，用微量注射器將各

6、組細胞多點注射到室壁瘤部位及周邊，
　　4.細胞移植后評價：移植4w后，用超聲心動圖和血流動力學方法大鼠測定心功能相關(guān)指標，用熒光顯微鏡觀察標記的細胞，并通過Masson氏三色染色法測定室壁瘤范圍。
　　三﹑結(jié)果
　　1.BMMSCs接種于培養(yǎng)瓶24h后，倒置顯微鏡下可見瓶底有少量細胞貼壁，體小而圓，漿少核大。3～4d后細胞呈集落樣生長，為不規(guī)則形、短梭形或多角形，之后漸變?yōu)榫鶆虻募忓N形、梭形，排列緊密。5-aza誘導

7、后，細胞逐漸變大、變長，形態(tài)不規(guī)則，2w后互相融合，形成肌管樣結(jié)構(gòu)，3w后肌管樣結(jié)構(gòu)增多，細胞走行趨向一致。4w后，細胞cTnI熒光染色陽性。
　　CFs貼壁和生長迅速，2～3d可呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，呈梭形，胞體和胞核較大，胞漿透明，無自發(fā)性搏動。2w后，細胞I型膠原蛋白免疫熒光染色陽性。
　　2.細胞移植4w后，超聲心動圖結(jié)果顯示：與對照組相比，移植ClCs、CFs或Comb組移植均可降低功能性室壁瘤的LVEDD與L

8、VESD[(8.749±0.091)mm、(8.587±0.481)mm、(8.131±0.130)mmvs(9.299±0.064)mm，P＜0.05；(5.109±0.171)mm、(4.991±0.054)mm、(4.682±0.089)mmvs(5.898±0.122)mm，P＜0.05]，且聯(lián)合移植的降低程度大于單一細胞移植(P＜0.05)。此外，移植ClCs或聯(lián)合移植均可顯著增高FS及EF[(32.70±1.283)％、(3

9、3.37±0.417)％vs(22.21±0.339)％，P＜0.05；(45.78±1.796)％、(47.22±0.594)％vs(31.09±0.475)％，P＜0.05]。
　　3.血流動力學結(jié)果顯示：與對照組相比，移植ClCs或聯(lián)合移植可明顯改善功能性室壁瘤的LVDP、(+dp/dtmax)和(-dp/dtmax)(152.9±0.669)mmHg、(163.7±2.142)mmHgvs(122.5±2.639)mmHg

10、，P＜0.05；(4109±33.86)mmHg/s、(4076±29.37)mmHg/svs(3223±73.50)mmHg/s，P＜0.05；(-3579±49.09)mmHg/s、(-3708±54.91)mmHg/svs(-2828±60.96)mmHg/s，P＜0.05]，然而，移植CFs后無明顯改善(P＞0.05)。
　　4.Masson氏法染色結(jié)果顯示：與對照組相比，移植ClCs、CFs或兩種細胞聯(lián)合移植均可顯著降低

11、室壁瘤范圍[(22.20±0.64)％、(22.11±0.77)％、(19.59±0.61)％vs(25.74±1.13)％，P＜0.05]，且聯(lián)合移植的降低幅度最為明顯(P＜0.05)。
　　5.熒光顯微鏡下可在ClCs組的細胞移植區(qū)觀察到有DAPI標記的心肌樣細胞；CFs組有CFSE標記的CFs綠色熒光的表達；Comb移植組可同時觀察到這兩種細胞，熒光細胞呈簇狀分布，細胞核形態(tài)相對規(guī)則。
　　四﹑結(jié)論
　　1.BM