同型半胱氨酸與胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能及細(xì)胞凋亡的關(guān)系及機(jī)制的研究.pdf

1、胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病的兩個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，不同人群在疾病的發(fā)展不同階段，這兩種異常的側(cè)重點(diǎn)有所不同，但只有β細(xì)胞功能缺陷、分泌胰島素的質(zhì)和量不足以維持正常葡萄糖代謝和難以克服胰島素抵抗時(shí)才會(huì)出現(xiàn)臨床高血糖。已有研究表明，β細(xì)胞功能受損與β細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。一項(xiàng)尸檢研究發(fā)現(xiàn)，空腹血糖受損(IFG)者和2型糖尿病患者β細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，并以后者為著；而且糖尿病患者體內(nèi)β細(xì)胞凋亡頻率明顯增高，但增生、復(fù)制功能正常，說明β

2、細(xì)胞凋亡增加是其數(shù)目減少的主要原因。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是不同于細(xì)胞壞死的一種死亡形式，指細(xì)胞在生理或病理情況下發(fā)生有序的主動(dòng)的非炎癥死亡，又稱程序性死亡。 目前有關(guān)2型糖尿病β細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究大多數(shù)集中在高糖毒性和脂毒性的作用上。長期的高血糖狀態(tài)可通過氧化應(yīng)激或非氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島素分泌減少和β細(xì)胞功能衰竭。在高糖條件下，可能通過改變Bcl基因家族中的平衡引起胰島β細(xì)胞凋亡。氧化損傷是引起許多組織

3、細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。與其他組織細(xì)胞相比，胰島細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶水平較低，因此，在一些因素的誘導(dǎo)下，容易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。而氧化和抗氧化作用失衡所致氧化應(yīng)激引起胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。 國內(nèi)外研究者對(duì)同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷已做了深入研究。但有關(guān)同型半胱氨酸對(duì)β細(xì)胞產(chǎn)生的可能影響的研究甚少。研究表明氧化應(yīng)激機(jī)制在同型半胱氨酸致血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷中均起著重要作用。本研究通過觀察不同

4、糖耐量人群血漿同型半胱氨酸水平和胰島細(xì)胞功能變化，探討同型半胱氨酸對(duì)胰島細(xì)胞功能存在的可能的影響。并進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)，用一種轉(zhuǎn)基因來源的小鼠β細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞，通過觀察同型半胱氨酸作用下細(xì)胞生長率和胰島素分泌的改變以及是否促使NIT-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，來探討同型半胱氨酸對(duì)胰島β細(xì)胞功能存在的可能負(fù)性影響，探討氧化應(yīng)激機(jī)制在β細(xì)胞損傷中的作用，為糖尿病的治療和胰島功能的保護(hù)提供新的思路。本研究共分為兩部分: 一、不同糖耐量人群

5、血漿同型半脫氨酸水平與胰島素抵杭及胰島β細(xì)胞功能關(guān)系的研究 目的：觀察不同糖耐量階段血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平，探討Hcy與胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系。 方法: 選擇12個(gè)月內(nèi)在我院健康查體的83名符合入選標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體，均行標(biāo)準(zhǔn)口服75克葡萄糖耐量試驗(yàn)，留取空腹血標(biāo)本測定血脂、肝腎功能、空腹胰島素、空腹血糖、Hcy、CRP等指標(biāo)，留取服糖后2小時(shí)血標(biāo)本測定餐后2小時(shí)血糖和胰島素

6、水平。同時(shí)留取尿液標(biāo)本測量尿微量白蛋白/肌酐水平。Hcy采用免疫熒光偏振法測定。 結(jié)果: 所有入選個(gè)體經(jīng)糖耐量試驗(yàn)證實(shí)有32例糖耐量正常(NGT)者，24例糖耐量減低(IGT)者和27例新診斷糖尿病(DM)者。血清CRP水平在NGT、IGT、DM各組中逐漸升高(P＜0.001)。IGT組和DM組腰圍、BMI顯著高于NGT組(P＜0.05，P＜0.01)。IGT組和DM組收縮壓均明顯高于NGT組(P＜0.01，P＜0.01

7、)，IGT組舒張壓明顯高于NGT組和DM組(P＜0.01，P＜0.01)。IGT組和DM組甘油三酯水平明顯高于NGT組，DM組總膽固醇水平顯著高于NGT組和IGT組，NGT組和IGT組總膽固醇水平無顯著差異(P＞0.05)。IGT組血肌酐水平明顯高于NGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，DM組肌酐水平與NGT組之間無顯著差別(P＞0.05)。IGT組和DM組空腹Hcy水平明顯高于NGT組，差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.

8、01)，IGT組Hcy水平略高于DM組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IGT組空腹胰島素水平顯著高于NGT組和DM組(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和DM組之間空腹胰島素水平無顯著差異(P＞0.05)。IGT組和DM組餐后2小時(shí)胰島素水平顯著高于NGT組(P＜0.01，P＜0.01)，DM組餐后2小時(shí)胰島素水平顯著低于IGT組，差異具有顯著性(P＜0.01)。IGT組和DM組HOMA-IR顯著高于NGT組，差異具有顯著性(P

9、＜0.01，P＜0.01)，IGT組和DM組ISI顯著低于NGT組，(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和IGT組HBCI顯著高于DM組，(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和IGT組HBCI無顯著差異(P＞0.05)，經(jīng)HOMA-IR校正之后，NGT組HBCI/IR顯著高于IGT組，(P＜0.01)。IGT組FBCI顯著高于NGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，經(jīng)HOMA-IR校正之后，NGT組FBCI/IR顯著高于

10、IGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，IGT組FBCI顯著高于DM組(P＜0.01)。NGT組的ΔI120/ΔG120、ΔI120/ΔG120/IR顯著高于IGT組和DM組，差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)，IGT組ΔI120/ΔG120、ΔI120/ΔG120/IR顯著高于DM組，差異具有顯著性(P＜0.01)。Spearman相關(guān)分析顯示Hcy與HOMA-IR(r=0.335，P=0.030)，與ISI(r=-

11、0.335，P=0.030)呈顯著負(fù)相關(guān)，與HBCI(r=-0.260，P=0.096)、FBCI(r=-0.039，P=0.808)和△I120/ΔG120(r=-0.253，P=0.107)呈負(fù)相關(guān)，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)HOMA-IR校正后，Hcy與HBCI/IR(r=-0.369，P=0.016)、FBCI/IR(r=-0.415，P=0.006)和△I120/ΔG120/IR(r=-0.335，P=0.030)呈顯著負(fù)相關(guān)性。多

12、元逐步回歸分析顯示，腰圍、尿Alb/Cr、FINS、HOMA-IR、FBCI和FBCI/IR對(duì)Hcy有顯著影響。 結(jié)論: 糖耐量異?；颊咻^糖耐量正常人相比往往合并更多的代謝異常，代謝綜合征的發(fā)生率高。糖耐量異?；颊咭葝u素抵抗、胰島β細(xì)胞功能受損程度明顯，且糖耐量受損者其血漿Hcy水平高于糖耐量正常者。胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損與糖耐量異常者血漿Hcy水平明顯相關(guān)。 二、同型半胱氨酸對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌及凋亡

13、的影響及機(jī)制的研究 目的: 觀察同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)對(duì)克隆的胰島β細(xì)胞NIT-1細(xì)胞株胰島素分泌、細(xì)胞生存率及細(xì)胞凋亡的影響，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的影響。 方法: 將Hcy作用于NIT-1細(xì)胞后，用放射免疫分析法檢測不同濃度Hcy作用不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞胰島素分泌的影響；用溴化(4，5二甲2噻唑基)2，5二苯基四氮唑分析法檢

14、測細(xì)胞生存率；流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法和瓊脂糖凝膠電泳檢測不同濃度的Hcy作用不同時(shí)間對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響；用黃嘌呤氧化酶法和WST結(jié)合的方法檢測Hcy作用后的NIT-1細(xì)胞內(nèi)SOD的活性。Western blot免疫印記法測定Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 50μmol/L的Hcy作用24h以及100μmol/L的Hcy作用12h后，細(xì)胞胰島素的分泌量較正常對(duì)照組相比分別下降了17.1％和

15、10.8％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01；P＜0.01)。100μmol/L的Hcy作用12h、24h后細(xì)胞存活率分別降至94.56％、87.93％，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)；50μmol/L的Hcy作用48h、72h后，細(xì)胞存活率分別降至91.26％、87.21％，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。當(dāng)100μmol/L Hcy作用24h，NIT-1細(xì)胞凋亡率為7.

16、21％(P＜0.01)；250μmol/L的Hcy作用12h，NIT-1細(xì)胞凋亡率為12.93％(P＜0.05)。瓊脂糖凝膠電泳顯示隨著Hcy濃度增加，凋亡NIT-1細(xì)胞的DNA電泳條帶呈現(xiàn)為明顯的梯形條帶。100μmol/L的Hcy作用24小時(shí)后NIT-1細(xì)胞內(nèi)SOD活性較正常組細(xì)胞下降20.2％(P＜0.01)。隨著Hcy濃度的增加，Bax的蛋白表達(dá)逐漸增加(P＜0.05)。結(jié)論 Hcy對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的抑制作用呈時(shí)間、劑

17、量依賴性。Hcy對(duì)細(xì)胞的生存率具有抑制作用，且可以用時(shí)間和濃度依賴性的方式誘導(dǎo)NIT-1細(xì)胞凋亡。這些有害作用可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)的SOD的活性而發(fā)揮作用，為研究保護(hù)胰島細(xì)胞功能提供一種新的思路。 結(jié)論: 1．糖耐量異常患者胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能受損程度明顯，且糖耐量受損者其血漿Hcy水平高于糖耐量正常者。胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損與糖耐量異常者血漿Hcy水平明顯相關(guān)。 2．同型半胱氨酸以時(shí)間、劑量依賴性