特發(fā)性脊柱側(cè)凸進(jìn)展停滯的褪黑素濃度依賴(lài)及機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　 特發(fā)性脊柱側(cè)凸是指一種脊柱的三維畸形,伴有椎體旋轉(zhuǎn),發(fā)病率約為2～3%,至今病因不明。一個(gè)好的建模方法對(duì)脊柱側(cè)凸的實(shí)驗(yàn)研究十分重要,但現(xiàn)有的建模方法存在以下不足:第一,模型的椎體無(wú)明顯旋轉(zhuǎn),而人類(lèi)脊柱側(cè)凸椎體多有明顯旋轉(zhuǎn);第二,模型不能模擬人類(lèi)的直立姿勢(shì),而直立姿勢(shì)明顯影響脊柱側(cè)凸的形成;第三,建模方式中存在對(duì)脊柱、脊髓和腺體等組織結(jié)構(gòu)的直接損傷,影響進(jìn)一步研究。本研究將利用雙足鼠模型能模擬人類(lèi)直立姿勢(shì)的特點(diǎn),采用經(jīng)

2、皮下拴系雙足鼠的肩胛下角與髂骨的方法建立脊柱側(cè)凸模型,探討此方法是否能更好地模擬人類(lèi)的脊柱側(cè)凸。
　　 褪黑素是一種主要由松果體合成的激素?；A(chǔ)研究證實(shí),切除雛雞、雙足鼠或魚(yú)的松果體可產(chǎn)生與人類(lèi)的特發(fā)性脊柱側(cè)凸非常相似的脊柱畸形。但是,腹腔內(nèi)注射褪黑素或?qū)⑶谐乃晒w自身移植是否能阻止這種實(shí)驗(yàn)性脊柱側(cè)凸的發(fā)生和發(fā)展,至今存在爭(zhēng)議。一個(gè)最新的前瞻性臨床研究顯示,進(jìn)行性加重的特發(fā)性脊柱側(cè)凸病人血中褪黑素水平明顯低于穩(wěn)定的特發(fā)性脊柱側(cè)

3、凸病人,而穩(wěn)定的特發(fā)性脊柱側(cè)凸病人血中褪黑素水平與正常人相似;對(duì)于那些褪黑素水平低下的病人,補(bǔ)充褪黑素可在一定程度上阻止其中一部分病人的畸形進(jìn)展,原因不清。
　　 究其原因,我們推測(cè)可能與應(yīng)用褪黑素的劑量有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn),特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進(jìn)展主要發(fā)生在骨骼的快速生長(zhǎng)期,其畸形程度與骨骼生長(zhǎng)能力有一種很好的相關(guān)性;特發(fā)性脊柱側(cè)凸女孩的身高明顯高于年齡和性別匹配的對(duì)照組;褪黑素可通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)生成,促進(jìn)骨的生成,但

4、沒(méi)有直接證據(jù)顯示褪黑素可抑制成骨細(xì)胞增殖。因此,本研究將探討褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞增殖是否存在濃度依賴(lài)性,并闡明其調(diào)控機(jī)理。
　　 材料與方法
　　 一、建模方法及動(dòng)物飼養(yǎng)
　　 采用4周齡、體重約70g的雌性Wistar大鼠45只,隨機(jī)分為三組。采用體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射(3ml/kg)麻醉。1組用愛(ài)惜康0號(hào)不可吸收絲線(xiàn)經(jīng)皮下進(jìn)行拴系,拴系左側(cè)肩胛下角和對(duì)側(cè)髂骨,程度為原肩胛下角到對(duì)側(cè)髂骨距離的85%～9

5、5%,使脊柱發(fā)生輕度右凸,再建立雙足鼠模型。2組采用左側(cè)肩胛下角和同側(cè)髂骨拴系,其余處理與1組完全相同。3組不建立雙足鼠模型外,其余處理與1組完全相同。所有大鼠均獨(dú)立飼養(yǎng),1組和2組用特制高籠,3組用標(biāo)準(zhǔn)鼠籠。拴系8周,第8周時(shí)剪斷拴系線(xiàn),再觀察2周。拴系后在皮膚表面可觸及拴系線(xiàn),如拴系失敗,重復(fù)手術(shù)過(guò)程。
　　 二、測(cè)量指標(biāo)
　　 拴系后即刻和術(shù)后第2、4、6、8、8’(拴系解除后即刻)、9、10周攝脊柱后前位和側(cè)位數(shù)

6、字化X線(xiàn)片。主要評(píng)價(jià)以下指標(biāo):手術(shù)時(shí)間、術(shù)后首次進(jìn)食時(shí)間、手術(shù)死亡率、體重、脊柱相對(duì)長(zhǎng)度、Cobb角、建模死亡率、二次手術(shù)率、脊柱側(cè)凸發(fā)生率、椎體旋轉(zhuǎn)發(fā)生率。
　　 三、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人成骨細(xì)胞系hFOB1.19用無(wú)酚紅的DMEM-F12培養(yǎng)基,填加10%胎牛血清,于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng),在8～11代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
　　 四、細(xì)胞增殖分析
　　 細(xì)胞以6000個(gè)/孔的密度接種到96孔板,24h后將

7、培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清和1nM～1mM濃度褪黑素的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h、48h或72h。然后,每孔加入200μl的無(wú)血清培養(yǎng)基和20μl的MTT(5mg/ml)孵育4h,在490nm處測(cè)OD值。
　　 五、細(xì)胞活力染色
　　 在暴露到1mM濃度褪黑素后,用胰酶消化,使懸浮細(xì)胞,用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色,在3min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。
　　 六、細(xì)胞周期分析
　　 細(xì)胞暴露到1nM～1

8、mM濃度褪黑素24h后,用胰酶消化,冰冷的PBS洗2次,固定在75%的乙醇中(4℃、2h)。然后,將細(xì)胞用PBS洗一次,填加500μl的PI染料在室溫染半小時(shí)后,取10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
　　 七、Westernblot
　　 用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞在4℃裂解30min,以12000轉(zhuǎn)、4℃離心15min,收集上清。用12%SDS-PAGE膠分離50ug的蛋白;將蛋白在低溫下以60v或40v轉(zhuǎn)到PVDF膜上;用5

9、%的脫脂牛奶或牛血清白蛋白封閉2h;根據(jù)說(shuō)明書(shū)的指示比例稀釋一抗,在4℃孵育過(guò)夜。以1:6000或1:8000比例稀釋含過(guò)氧化物酶的抗小鼠或抗兔的二抗,在室溫孵育2h后進(jìn)行ECL顯色,GAPDH作內(nèi)參。
　　 八、實(shí)時(shí)定量PCR
　　 根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明,用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒,在ABIPrism7900HTFastSyste

10、m上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:95℃、30s;95℃、5s,60℃、30s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,通過(guò)分析融解曲線(xiàn)以證實(shí)結(jié)果的可靠性。
　　 九、免疫共沉淀
　　 在細(xì)胞暴露到PD98059(50μM)或褪黑素(1mM)24h后,提取細(xì)胞蛋白,根據(jù)proteinA/Gbeads說(shuō)明書(shū)操作,樣品制備好后用westem-blot檢測(cè)。
　　 十、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。有關(guān)率的指標(biāo)用Fisher確切概率法,其余指標(biāo)均按分組及拴系術(shù)后時(shí)間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),然后行組間或組內(nèi)單因素方差分析。用線(xiàn)性回歸的方法分析拴系后即刻與術(shù)后第8’周、拴系后即刻與術(shù)后第10周、術(shù)后第8’周與術(shù)后第10周冠狀面Cobb角之間的相關(guān)性。用雙因素方差分析評(píng)價(jià)褪黑素劑量、暴露時(shí)間或二者交互作用對(duì)結(jié)果的影響:在隨后的亞組分析中,分別采用Dunnett檢驗(yàn)和LSD檢驗(yàn)分析褪黑素劑量和暴露時(shí)間的影響;采用多項(xiàng)式對(duì)比進(jìn)行趨勢(shì)檢

12、驗(yàn);利用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析評(píng)價(jià)各處理組間的不同。與對(duì)照組相比,基因水平的相對(duì)定量值在0.5以下或2以上時(shí),被認(rèn)為有顯著性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a值取雙側(cè)0.05。
　　 結(jié)果
　　 一、建模方式的不同沒(méi)有影響到大鼠術(shù)后的恢復(fù)和生長(zhǎng)發(fā)育
　　 雖然1組和2組手術(shù)時(shí)間長(zhǎng),但拴系后再建立雙足鼠模型并未影響大鼠術(shù)后恢復(fù)。三組大鼠在術(shù)中及術(shù)后6h內(nèi)均無(wú)死亡發(fā)生,除手術(shù)過(guò)程中有少量滲血外,均無(wú)出血,表明建立雙足鼠模型未增加

13、手術(shù)死亡的風(fēng)險(xiǎn)。每次測(cè)量時(shí),三組間體重和脊柱相對(duì)長(zhǎng)度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明不同的建模方式未使三組大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不同。
　　 二、1組的建模方法能增加脊柱側(cè)后凸的程度和椎體旋轉(zhuǎn)的發(fā)生率
　　 在術(shù)后第8’周至第10周,三組冠狀面Cobb角的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明大鼠的脊柱側(cè)凸程度穩(wěn)定,模型有效。三組大鼠拴系后即刻與術(shù)后第8’周和術(shù)后第10周的冠狀面C0bb角均無(wú)相關(guān)性。術(shù)后第8’周與術(shù)后第10周的冠狀面Cobb角

14、之間高度相關(guān)。三組的建模死亡率、二次手術(shù)率和脊柱側(cè)凸發(fā)生率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1組的椎體旋轉(zhuǎn)發(fā)生率大于2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、褪黑素不僅促進(jìn)還能抑制成骨細(xì)胞增殖
　　 褪黑素誘導(dǎo)了一種劑量依賴(lài)性和時(shí)問(wèn)依賴(lài)性效應(yīng);這種效應(yīng)與二者的交互作用無(wú)關(guān);1mM濃度褪黑素顯著抑制了成骨細(xì)胞增殖,而1nM～100μM濃度褪黑素促進(jìn)了成骨細(xì)胞增殖;在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均存在顯著不同,且隨著暴露時(shí)間增加表現(xiàn)出一種線(xiàn)性趨勢(shì)。

15、　　 四、1mM濃度褪黑素沒(méi)有造成細(xì)胞死亡
　　 當(dāng)細(xì)胞活力以相對(duì)于對(duì)照組的百分比表示時(shí),無(wú)論在24h、48h或72h,二組間均無(wú)顯著差異;即使細(xì)胞暴露到1mM濃度褪黑素72h,細(xì)胞活力仍然是99%。五、1mM濃度褪黑素通過(guò)增加G0/G1期和減少G2/M期誘導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯
　　 當(dāng)細(xì)胞暴露到各種濃度褪黑素24h后,1mM濃度褪黑素顯著增加了G0/G1期和減少了G2/M期的比例,但沒(méi)有明顯影響到S期;這些變化在細(xì)胞同步

16、到G期后更明顯。相反,1nM～10μM濃度褪黑素誘導(dǎo)了一種輕微促細(xì)胞周期進(jìn)展的趨勢(shì),在G2/M期最為明顯,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 六、1mM濃度褪黑素下調(diào)了cyclinD1、CDK4、cyclinB1和CDK1的表達(dá)
　　 1mM濃度褪黑素顯著下調(diào)了cyclinD1和CDK4(與G0/G1期進(jìn)展有關(guān))及cyclinB1和CDKl(與G2/M期進(jìn)展有關(guān))的表達(dá);對(duì)cyclinE、CDK2和cyclinA(與G1/S期轉(zhuǎn)變

17、和S期進(jìn)展有關(guān))的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　 七、1mM濃度褪黑素抑制了ERK的磷酸化
　　 1mM濃度褪黑素以一種時(shí)間依賴(lài)性方式顯著抑制了ERK的磷酸化,但是沒(méi)有明顯影響p38、JNK和Akt的磷酸化及ERK、p38、JNK和Akt的表達(dá)。
　　 八、PD98059和1mM濃度褪黑素協(xié)同阻斷了ERK的激活
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,50μM濃度的PD98059可有效阻斷ERK的激活。PD98059(

18、50μM)和褪黑素(1mM)或二者共同作用于細(xì)胞24h后(特別在共同作用下),有效地阻斷了ERK在成骨細(xì)胞中的激活。與PD98059或褪黑素單獨(dú)作用相比,這種聯(lián)合作用協(xié)同地增強(qiáng)了ERK磷酸化的抑制作用。
　　 九、PD98059和1mM濃度褪黑素協(xié)同抑制了細(xì)胞增殖
　　 MTT增殖分析顯示,PD98059(甚至在作用1小時(shí)后移除)或褪黑素(尤其是在二者聯(lián)合時(shí))顯著地抑制了成骨細(xì)胞增殖。這種聯(lián)合作用協(xié)同地增加了抗成骨細(xì)胞增

19、殖效應(yīng)的事實(shí)表明,ERK激活的破壞與褪黑素誘導(dǎo)的抗成骨細(xì)胞增殖效應(yīng)密切相關(guān)。
　　 十、PD98059和1mM濃度褪黑素協(xié)同影響了G1和G2/M期分布
　　 流式細(xì)胞術(shù)P1單染分析顯示,PD98059或褪黑素(尤其是在二者聯(lián)合時(shí))顯著增加了細(xì)胞周期G0/G1期比例,同時(shí)減少了細(xì)胞周期G2/M期比例,對(duì)S期沒(méi)有明顯影響。與PD98059或褪黑素單獨(dú)作用相比,這種聯(lián)合作用協(xié)同地增加了細(xì)胞周期分布的改變,表明ERK激活的阻斷與

20、褪黑素介導(dǎo)的G1和G2/M期停滯有關(guān)。
　　 十一、PD98059和1mM濃度褪黑素協(xié)同影響了cyclinD1、CDK4、cyclinB1和CDK1的表達(dá)
　　 Westernblot和real-timePCR分析顯示,PD98059或褪黑素(尤其是在二者聯(lián)合時(shí))顯著減少了這些基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。與PD98059或褪黑素單獨(dú)作用相比,這種聯(lián)合協(xié)同作用明顯造成了這些基因表達(dá)的下調(diào),表明ERK激活的阻斷與這些基因

21、表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。
　　 十二、PD98059和1mM濃度褪黑素可抑制p-ERK與G1和G2/M期基因之間的相互作用
　　 免疫共沉淀分析顯示,在p-ERK和cyclinD1、CDK4、cyclinBl或CDKl之間有一種顯著的相互作用,反之亦然,并且這種作用可被褪黑素或PD98059的處理所削弱。
　　 結(jié)論
　　 椎骨的斜向和垂直應(yīng)力可分別增加椎體旋轉(zhuǎn)的發(fā)生和脊柱側(cè)后凸的程度,雙足鼠對(duì)側(cè)拴系模型能更好地