VEGI調(diào)節(jié)顱腦創(chuàng)傷后腦水腫的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　1、通過觀察VEGI(Vascular Endothelial Growth Inhibitor)在創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury，TBI)后小鼠的血腦屏障調(diào)控作用，腦水腫抑制作用，以及神經(jīng)功能的恢復(fù)改善情況，明確其在腦創(chuàng)傷的功能作用，并初步探討其潛在作用機制。
　　2、通過觀察VEGI在VEGF-A(Vascular Endothelial Growth Factor A)所誘導(dǎo)

2、的體外血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）模型滲漏的抑制作用，上調(diào)緊密連接蛋白作用，并在形態(tài)學(xué)上進行確認(rèn)，明確VEGI能夠抑制VEGFR2受體的磷酸化從而抑制VEGF-A所造成的BBB滲漏，并初步探討其在細(xì)胞水平的作用機制。
　　研究方法:
　　1、體內(nèi)試驗部分:本實驗選用清潔級健康成年C57B1/6小鼠，隨機分為實驗組1（空白對照組）、實驗組2（假手術(shù)組）、實驗組3（單純TBI組）和實驗組4（TBI+

3、VEGI組）。分組后，我們建立小鼠液壓打擊顱腦創(chuàng)傷模型，應(yīng)用小鼠神經(jīng)功能評分和Morris水迷宮評價其行為學(xué)功能，并應(yīng)用尹文思藍、免疫熒光技術(shù)對小鼠血腦屏障的滲漏、緊密連接蛋白、血管標(biāo)記進行檢測。
　　2、體外實驗部分:本實驗利用C57小鼠的鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3構(gòu)建體外血腦屏障模型，隨機分為實驗組1（空白對照組）、實驗組2（VEGI組）、實驗組3（VEGF-A組）和實驗組4（VEGF-A+VEGI組）。分組后，我們利用所

4、構(gòu)建的血腦屏障模型，測量細(xì)胞的跨膜電阻值檢測血腦屏障滲漏的程度，并利用免疫熒光技術(shù)、Western Blot技術(shù)測定緊密連接蛋白的表達程度，并利用跳躍探針式離子電導(dǎo)顯微鏡(Hopping Probe Ion Conductance Microscopy，HPICM)連續(xù)實時觀測緊密連接的納米級形態(tài)學(xué)變化。
　　研究結(jié)果:
　　1、體內(nèi)試驗部分:液壓打擊后，實驗組3和實驗組4的小鼠在遭受液壓打擊后，mNSS評分立即升高，在傷后

5、12小時，兩組間評分無統(tǒng)計學(xué)差異，但隨著傷情的逐漸恢復(fù)，差異漸漸呈現(xiàn)。在傷后24小時，遭受創(chuàng)傷的實驗組3小鼠評分高于實驗組4(P＜0.01)，這種差異在受傷后的第7天消失。Morris水迷宮定位航行測試中，實驗組3和實驗組4中，TBI組的小鼠于第三天開始，與假手術(shù)組相比較出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)差異，這種差異一直保持至第五天訓(xùn)練結(jié)束;Morris水迷宮空間探索測試中，實驗組3和實驗組4與實驗組1和實驗組2相比較之間存在著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，其目標(biāo)象限

6、百分比均明顯下降(P＜0.01)，實驗組3和實驗組4相比較也出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。實驗組3相比較實驗組4的EB滲漏率明顯更低（P＜0.01）。免疫熒光也顯示實驗組3與實驗組4之間，CLN5、Alb的表達存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。
　　2、體外實驗部分:體外培養(yǎng)的bEnd.3細(xì)胞得TEER(Ω·cm2)的所測值中，對照組、VEGI預(yù)處理組以及VEGI+VEGF組之間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而VEGF組相對于對照組明

7、顯下降(P＜0.01)。在HPICM連續(xù)24h觀測中，空白對照組、VEGI預(yù)處理組、VEGI+VEGF組的bEnd.3細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞間緊密連接基本未發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，然而VEGF組卻在加入100ng/ml VEGF-A之后16h逐漸出現(xiàn)了緊密連接高度的降低，并隨時間的推移這種高度的降低更加明顯;并且，這種變化還體現(xiàn)在相對粗糙度的變化上(P＜0.01)。免疫熒光檢測中發(fā)現(xiàn):VEGF-A可明顯降低Claudin-5的表達(P＜0.01

8、)，但這種抑制作用可被VEGI所抑制。在Western Blot檢測中，可見，100ng/ml VEGF-A可明顯降低Claudin-5、Occlaudin的表達(P＜0.01)，但未對ZO-1的表達造成任何統(tǒng)計學(xué)上的差異。并且，相對于VEGF-A組，VEGI+VEGF-A組可明顯抑制VEGF-A對Claudin-5、Occlaudin的下調(diào)作用;VEGFR2上的pY1175位點的磷酸化可被VEGF-A激活，但VEGI對這種VEGF-A

9、誘導(dǎo)的磷酸化具有抑制作用。
　　研究結(jié)論:
　　1、在體實驗:VEGI可以抑制TBI后小鼠的繼發(fā)性腦水腫、減輕血腦屏障的滲漏、上調(diào)緊密連接蛋白，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而改善小鼠腦神經(jīng)功能及行為學(xué)指標(biāo)，為開發(fā)VEGI治療TBI后腦水腫提供了實驗依據(jù)。
　　2、體外實驗:VEGI可以抑制VEGF-A所誘導(dǎo)的BBB體外模型的滲漏、上調(diào)緊密連接蛋白，我們首次利用HPICM觀測到了bEND.3在VEGI/VEGF-A的作用下所表現(xiàn)