SCN5A基因突變-缺失致竇房結(jié)功能改變的研究.pdf

1、第一部分、SCN5A基因點(diǎn)突變致病態(tài)竇房結(jié)綜合征分子機(jī)制的研究。 目的：SCN5A基因點(diǎn)突變E161K，T187I和L212P對(duì)Nav1.5通道的動(dòng)力學(xué)以及通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 方法：采用定點(diǎn)突變的方法，得到含有E161K，T187I和L212P的SCN5A突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人胚胎腎293細(xì)胞（HEK293細(xì)胞），用膜片鉗記錄Nav1.5 激活，失活和恢復(fù)等通道動(dòng)力學(xué)改變。在Nav1.5通道跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅰ的第一和第二個(gè)跨膜片段

2、胞外連接處插入flag序列，與Nav1.5通道共表達(dá)，了解三個(gè)突變點(diǎn)對(duì)通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)是否有影響。 結(jié)果：正常鈉通道在-20mv時(shí)，鈉通道的電流最大，峰電流密度約為800pA/pF，激活曲線V1/2為-33.8±0.7mV，斜率K為6.7±0.2；失活曲線V1/2為-80.3±0.9mV，斜率K為6.2±0.1。T187I峰電流值減少約100％；E161K峰電流值減少約70％，L212P峰電流基本不變。E161K激活曲線明顯右移，

3、激活曲線斜率K為8.8±0.1mV，V1/2為-14.9±0.6mV，激活速度減慢，P<0.01；穩(wěn)態(tài)失活曲線與正常接近，k為-6.5±0.2mV，V1/2為-78.4±0.8mV，通道失活不變。L212P其激活曲線明顯左移，激活加快，激活曲線斜率k為8.4±0.2mV，V1/2為-14.9±0.6mV，通道激活速度加快，P<0.01；穩(wěn)態(tài)失活曲線明顯左移，曲線斜率k為-5.2±0.1mV，V1/2為-90.7±1.1mV，失活加快，P

4、<0.01。E161K和L212P突變對(duì)通道的恢復(fù)無明顯影響。三種突變通道上的Flag均能正常的表達(dá)在細(xì)胞膜上。 結(jié)論：T187I表現(xiàn)為Nav1.5通道失功能；E161K和L212P表現(xiàn)為Nav1.5通道功能減弱。三種突變Nav1.5通道均能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面。 第二部分、Scn5a基因敲除小鼠模型的建立及鑒定。 目的：建立Scn5a基因敲除雜合子（Scn5a+/-）小鼠模型。 方法：采用基因打靶技術(shù)，D

5、NA同源重組的方法，建立Scn5a+/-小鼠模型。選擇一組5月齡的同期培育的Scn5a+/-小鼠和正常野生型小鼠，取鼠尾提取DNA行PCR鑒定。分離小鼠的心室肌細(xì)胞，應(yīng)用抗α-actin抗體鑒定分離下來的心室肌細(xì)胞。利用膜片鉗技術(shù)記錄Nav1.5通道電流。比較Nav1.5通道動(dòng)力學(xué)的變化。 結(jié)果：PCR結(jié)果顯示野生型小鼠在980Bp處出現(xiàn)一條帶，而Scn5a+/-小鼠則在980Bp和650Bp處各出現(xiàn)一條條帶。與正常野生型小鼠相

6、比，Scn5a+/-小鼠心室肌細(xì)胞鈉電流峰電流密度減少約45％（16±6PA/PF vs 34±8PA/PF，n=5，P<0.05）；其激活，失活曲線的半數(shù)有效電壓和斜率均沒有改變，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：Scn5a+/-小鼠可以很好的被用來作為研究Nav1.5通道異常的疾病模型。 第三部分、Scn5a基因敲除小鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙的電生理研究。 目的：探討Scn5a基因敲除雜合子（Scn5a+/-）小鼠竇房結(jié)等

7、傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙的原因。 方法：記錄小鼠離體心臟的心表心電圖，觀察心率和節(jié)律的改變。通過電mapping了解竇房結(jié)發(fā)放沖動(dòng)傳導(dǎo)至外周冠狀竇的時(shí)間。膜片鉗技術(shù)檢測(cè)小鼠竇房結(jié)細(xì)胞Nav1.5通道電流和功能。局部組織冰凍切片免疫組織化學(xué)檢測(cè)竇房結(jié)區(qū)Nav1.5通道蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：與野生型小鼠相比，Scn5a+/-小鼠的心率明顯減慢（259±27 bpm VS 336±8bpm，P<0.05,n=6），并且該組小鼠間的心率變

8、異度也大，并且出現(xiàn)2：1的房室傳導(dǎo)阻滯；心表心電圖上顯示為P波時(shí)限(12.91±4.17ms VS 22.35±6.44ms，P<0.05,n=6)和PR間期延長(44.22±5.98ms VS 66.81±8.24ms，P<0.01,n=6) ;電mapping顯示由竇房結(jié)發(fā)出的沖動(dòng)傳導(dǎo)到冠狀竇的時(shí)間延長(8.16±1.36ms vs 3.56±0.26ms P<0.05,n=6)。Scn5a+/-小鼠竇房結(jié)細(xì)胞Nav1.5 通道最大