脂肪組織中腫瘤壞死因子-α與血漿纖溶酶原激活抑制物-1相關(guān)性的研究.pdf

1、本研究旨在探討TNF-α對心血管系統(tǒng)疾病的作用及其機制。本研究檢測了受試者網(wǎng)膜脂肪組織和皮下脂肪組織中TNF-α表達(dá)、空腹血糖、胰島素、血脂及血漿中PAI-1的水平等臨床參數(shù)，探討TNF-α與胰島素抵抗、血脂異常癥和心血管系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系。并進行了體外試驗，觀察TNF-α對內(nèi)皮細(xì)胞中Egr-1蛋白表達(dá)的影響，探討TNF-α引起心血管系統(tǒng)疾病的機制。 材料與方法： 1、選取進行腹部外科手術(shù)的肥胖患者和正常體重的對照組患者

2、，進行常規(guī)指標(biāo)的測定，包括體重、身高、腰圍。 2、采用酶學(xué)方法測定血糖、血膽固醇、血高密度脂蛋白膽固醇水平；采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定胰島素、C 肽水平。計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。 3、采用免疫組化方法和western blot方法檢測受試者腹部皮下脂肪和網(wǎng)膜脂肪中TNF-α的表達(dá)。 4、ELISA方法檢測受試者血清中PAI-1的水平。 5、采用人臍

3、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)的方法，TNF-α和/或葡萄糖與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育，收集內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液。加入MEK抑制劑(PD98059)進行干預(yù)，收集內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液。 6、采用western blot方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中Egr-1、ERK1/2蛋白的表達(dá)。 7、采用ELISA方法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中PAI-1水平。 結(jié)果： 1、男性和女性受試者測量和代謝指標(biāo)的數(shù)據(jù)表明無論在男性還是女性組，肥胖者BMI、腰圍、

4、空腹胰島素水平、HOMA-IR、甘油三酯、膽固醇和血漿PAI-1水平均高于正常對照組，而HDL-C水平低于正常對照組。 2、肥胖組網(wǎng)膜脂肪和皮下脂肪標(biāo)本中TNF-α蛋白水平均高于正常對照組。 3、在女性肥胖受試者中兩處脂肪細(xì)胞的大小與其對應(yīng)的TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.779，P<0.01，網(wǎng)膜脂肪處；r=0.452，P<0.05，皮下脂肪處)。在男性肥胖受試者中，僅在網(wǎng)膜脂肪處兩者成正相關(guān)(r=0.828，P<0

5、.01)。 4、在女性肥胖受試者中，網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞TNF-α的表達(dá)與空腹血糖濃度呈正相關(guān)(r=0.541，P<0.05)，與空腹胰島素呈正相關(guān)(r=0.599，P<0.01)，與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.546，P<0.05)，與甘油三酯呈顯著正相關(guān)(r=0.469，P<0.05)，與高密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān)(r=-0.759，P<0.01)。這些參數(shù)與皮下脂肪TNF-α表達(dá)不相關(guān)。在男性肥胖組中，兩處脂肪TNF-α的表達(dá)

6、與HOMA-IR均無明顯相關(guān)，但網(wǎng)膜脂肪TNF-a表達(dá)與葡萄糖水平正相關(guān)(r=0.762，P<0.01)，與胰島素水平正相關(guān)(r=0.622，P<0.05)，與甘油三酯水平正相關(guān)(r=0.650，P<0.05)，與高密度脂蛋白膽固醇水平負(fù)相關(guān)(r=-0.880，P<0.01)。男性肥胖受試者中皮下脂肪TNF-α的表達(dá)與葡萄糖、胰島素、甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯相關(guān)性。 5、在女性和男性肥胖受試者中，可見網(wǎng)膜脂肪 TN

7、F-α蛋白的表達(dá)水平與血漿PAI-1水平呈顯著正相關(guān)(女性：n=20，r=0.763，P<0.01；男性：n=12，=0.760，P<0.01)。 6、25mmo1/l葡萄糖、10ng/ml TNF-α使Egr-1水平的變化如下：TNF-α使Egr-1升高后即回落，高峰在60分鐘，葡萄糖使Egr-1表達(dá)的高峰亦在60分鐘，但Egr-1的表達(dá)持續(xù)升高直至240分鐘。 7、葡萄糖與TNF-α共同孵育的內(nèi)皮細(xì)胞Egr-1表達(dá)較

8、葡萄糖和TNF-α單獨作用升高分別達(dá)2.64倍、2.34倍(P<0.05)，比其單獨作用都要高，說明葡萄糖和TNF-α對Egr-1的表達(dá)的影響具有協(xié)同作用。 8、細(xì)胞與PD98059(20μmol/l)孵育后各組Egr-1的表達(dá)較空白對照組、葡萄糖孵育組和TNF-α孵育組Egr-1蛋白表達(dá)分別降低16.92％、13.99％、63.08％(P<0.05)。10ng/ml TNF-α可以使25mmol/l葡萄糖孵育的ERK1/2水平

9、升高1.76倍(P<0.05)，25mmol/l葡萄糖加入到10ng/ml TNF-α孵育后的內(nèi)皮細(xì)胞中，葡萄糖不能提高ERK1/2的活性(P>0.05)。 9、25mmol/l葡萄糖、10ng/ml TNF-α可使內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中PAI-1水平升高，與PD98059孵育后葡萄糖組和TNF-α組PAI-1水平分別降低了30.43％、66.67％(P<0.05)。 討論： 肥胖根據(jù)脂肪組織分布的位置不同而分為中心型

10、肥胖和外周型肥胖。中心型肥胖即內(nèi)臟型肥胖，是指脂肪堆積在大網(wǎng)膜和腸系膜的脂肪處。外周型肥胖，通常是指皮下脂肪的堆積。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肥胖相關(guān)的并發(fā)癥，如胰島素抵抗、2型糖尿病、血脂異常癥、心血管系統(tǒng)疾病等，與內(nèi)臟型肥胖的關(guān)系更加密切，但其機制目前還不十分清楚。分子水平的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪表達(dá)的IL-6、IL-8、PAI-1、血管緊張素原等均高于皮下脂肪，因而很可能是由于內(nèi)臟脂肪不同的生物學(xué)性質(zhì)，引起了中心型肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生。

11、 脂肪細(xì)胞的大小是細(xì)胞因子合成的一個重要的決定因素，Gábor Winkler等報道脂肪細(xì)胞的大小是TNF-α產(chǎn)生和胰島素抵抗的決定因素。本研究測定了兩處脂肪細(xì)胞的大小，結(jié)果顯示網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞小于皮下脂肪細(xì)胞。在兩處脂肪細(xì)胞中，脂肪細(xì)胞的大小與TNF-α表達(dá)呈正相關(guān)，這一結(jié)果與受試者的代謝狀況或是各種激素、因子的不同無關(guān)，因為兩處脂肪來源于同一受試者。因而，脂肪細(xì)胞大小不是決定TNF-α表達(dá)的唯一決定因素，TNF-α的表達(dá)還決定于脂肪組織

12、所處的解剖位置。 網(wǎng)膜脂肪TNF-α蛋白與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，這與Sada KE的報道相一致，說明TNF-α在內(nèi)臟脂肪堆積引發(fā)胰島素抵抗的過程中起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜脂肪組織表達(dá)的TNF-α與甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟脂肪比皮下脂肪的脂解能力要強，本研究進一步支持這一觀點。網(wǎng)膜脂肪可通過分泌TNF-α而促進脂解，使游離脂肪酸增加，進一步促進了胰島素抵抗、血脂異常癥以及心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生。

13、 纖溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是纖維蛋白溶解系統(tǒng)主要的調(diào)節(jié)因子。PAI-1是重要的纖溶酶原活化的抑制劑，它的增加可以打亂正常的纖維蛋白清除機制而促進血栓的形成。PAI-1在肥胖患者中水平顯著升高，是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的獨立危險因素。網(wǎng)膜脂肪TNF-α的表達(dá)與血漿PAI-1水平的顯著相關(guān)，表明了網(wǎng)膜脂肪TNF-α在肥胖相關(guān)心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生中起到了重要的作用。TNF-α可促進脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)

14、PAI-1，使血漿中PAI-1的水平升高，從而增加了心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的危險性。 血糖和TNF-α不同水平對Egr-1表達(dá)的影響研究結(jié)果表明，TNF-α、高葡萄糖均可增加Egr-1的表達(dá)，且二者可協(xié)同作用增加Egr-1的表達(dá)。TNF-α可活化內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1/2和Egr-1的表達(dá)，并且TNF-α依賴于ERK1/2途徑誘導(dǎo)Egr-1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。 TNF-α依賴ERK1/2路徑介導(dǎo)Egr-1的表達(dá)，因而ERK1/2

15、路徑在血管病變發(fā)生中起到了重要作用，研究表明接受ERK1/2的反義治療可減少動脈粥樣硬化的形成。ERK1/2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化和增殖，還與動脈粥樣硬化的改變密切相關(guān)，抑制ERK1/2路徑是可以達(dá)到保護心血管的效益的，但同時也可能擾亂正常細(xì)胞的生長分化和增殖。本實驗用到的是MEK抑制劑，目前尚無特異性選擇ERK1/2的抑制劑應(yīng)用于臨床。 因而，TNF-α在內(nèi)臟脂肪的堆積與胰島素抵抗、血脂異常癥等相關(guān)疾病的發(fā)生中起到了中心介質(zhì)的

16、作用。對于其進一步分子機制的研究將有益于中心型肥胖患者并發(fā)癥的預(yù)防和治療策略的制定。本研究表明了Egr-1在血管并發(fā)癥中重要的中心環(huán)節(jié)作用，以及在動脈粥樣硬化形成過程中的重要意義。TNF-α和葡萄糖使血管內(nèi)皮細(xì)胞Egr-1上調(diào)是糖尿病發(fā)生血管并發(fā)癥的初始事件，對以后在這一環(huán)節(jié)進行抑制從而達(dá)到治療血管并發(fā)癥的作用提供了重要的理論支持。 結(jié)論： 1、肥胖者網(wǎng)膜脂肪處TNF-α蛋白水平的高表達(dá)與肥胖相關(guān)胰島素抵抗、心血管系統(tǒng)疾