三種復(fù)合BMP的骨移植材料對膝關(guān)節(jié)韌帶創(chuàng)傷修復(fù)的研究.pdf

1、骨科學(xué)權(quán)威著作《坎貝爾手術(shù)學(xué)》提出“膝關(guān)節(jié)是所有關(guān)節(jié)中最易受損傷的關(guān)節(jié)”，其中前交叉韌帶（anterior cruciate ligament,ACL）是穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，在膝部各韌帶損傷中最常見，其斷裂幾率高達70％以上。由于無法自行愈合，ACL斷裂后通過手術(shù)方式進行重建已成為共識。常用自體移植物進行重建，其中應(yīng)用最多的是骨-髕腱-骨(BPTB)及腘繩肌肌腱移植。但BPTB由于供區(qū)并發(fā)癥的問題使用率開始下降，而自體腘繩肌肌腱重建A

2、CL技術(shù)日趨成熟，因其供區(qū)病損小，對伸膝裝置無干擾，可取得與采用BPTB重建類似的膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定效果，因而已成為目前的主流重建方式。但有臨床報道，采用自體腘繩肌肌腱重建ACL后，術(shù)后可出現(xiàn)關(guān)節(jié)不穩(wěn)，主要是由于腱-骨愈合不良所致。
　　因此移植肌腱與骨隧道之間及早、可靠地愈合，即高質(zhì)量的腱-骨愈合，是ACL重建手術(shù)成功的關(guān)鍵。而關(guān)于肌腱在骨隧道內(nèi)愈合機制，至今未有確切表述，但學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腱-骨愈合過程中，新生骨向肌腱方向長入的過程是主

3、要的，而且腱-骨間生物力學(xué)功能的提高與新生骨長入的程度呈正相關(guān)。因此促進腱-骨間新生骨長入，成為促進腱-骨間生物愈合的有力措施。
　　研究顯示，腱-骨間骨生長的過程類似于骨折愈合的過程。從組織工程技術(shù)的角度考慮，骨隧道內(nèi)原已存在的骨髓提供了多分化潛能細胞來源，選擇具有明顯誘導(dǎo)成骨效果的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）作為生長因子可促進骨生長，然而選擇什么樣的支架作為BMP的適合載體至今未有定論，尤其在ACL重建過程中。因此，本實驗通過探討

4、不同類型、不同特性的載體材料負載BMP應(yīng)用于ACL重建中，通過組織學(xué)、生物力學(xué)及Micro-CT等影像學(xué)各方面的檢測，試圖尋找符合ACL重建應(yīng)用要求且具有良好成骨效果的支架。本課題中我們首次比較了負載BMP的注射型與固態(tài)型載體在ACL重建中促進腱-骨愈合的不同作用，探討了具有三維立體結(jié)構(gòu)多孔隙的支架材料在ACL重建術(shù)中促進腱-骨愈合的效果。
　　本課題主要從以下四個方面進行了具體研究。
　　1、三種不同載體材料復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生

5、蛋白構(gòu)建的復(fù)合生物材料特性的實驗研究
　　將牛BMP與三種具有良好生物相容性、臨床常用但使用方法及物理特性不同的載體材料復(fù)合，比較復(fù)合后的三種生物材料之間的不同。注射型纖維蛋白膠（FG）及磷酸鈣骨水泥（CPC）分別與BMP混合形成復(fù)合材料的初凝時間（IT）和終凝時間（FT）與單純FG及CPC相比均無顯著性差異。掃描電鏡圖像顯示，F(xiàn)G由細小顆粒組成，結(jié)構(gòu)平整，未見大孔隙出現(xiàn)。復(fù)合BMP后表面結(jié)構(gòu)變得粗糙，有較為均一、但直徑明顯增大的

6、BMP粉末黏著，之間有微孔結(jié)構(gòu)；CPC則由不規(guī)則的扁平狀、顆粒狀和塊狀晶體組成，晶體間有不規(guī)則的孔隙，孔隙大小為2-20μm。與BMP復(fù)合后仍由上述形態(tài)的晶體構(gòu)成，晶體上和孔隙間均勻地附著大量絮狀BMP顆粒，晶體間孔徑較單純的CPC略大，約為5-50μm；牛松質(zhì)骨(bCB)呈現(xiàn)規(guī)則孔隙結(jié)構(gòu)，包含大孔（300-500μm直徑）和小的交通孔（50-80μm直徑），復(fù)合后的RBX可見棉絮狀BMP物質(zhì)充填在孔隙當(dāng)中。材料生物力學(xué)結(jié)果證明，三種復(fù)

7、合材料的最大抗壓強度均略有降低，但與單純材料組相比較，均無顯著性差異。而小鼠肌袋實驗結(jié)果表明，術(shù)后2周，三種復(fù)合材料組的ALP酶活性均較單純bBMP組顯著性增高，其中RBX組最高。組織學(xué)結(jié)果同樣證明，三組復(fù)合材料組均比單純BMP組成骨效果明顯。以上結(jié)果證明，三種材料復(fù)合BMP后，都增強了BMP誘導(dǎo)成骨作用，而材料自身的特性并未因BMP的載入而受到負面影響。這些實驗結(jié)果為我們下一步進行復(fù)合材料細胞相容性相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2、

8、兔骨髓基質(zhì)干細胞在復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白的三種載體材料上增殖和分化的對比研究
　　將兔骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC）接種在三種復(fù)合材料上，觀察它們對BMSC增殖和分化的影響。MTT測試結(jié)果顯示，RBX組和CPC復(fù)合組在整個實驗期內(nèi)，與空白對照組及對照組相比較，對BMSC有明顯的促增殖作用，其中RBX組總體強于CPC復(fù)合組；而FG復(fù)合組在試驗期內(nèi)對BMSC的增殖效應(yīng)在第6-8天時高于RBX組和CPC復(fù)合組（p＜0.05），第10天開始低于這

9、兩組。細胞的ALP酶活性測定結(jié)果顯示，7天時，F(xiàn)G復(fù)合組ALP酶活性分別高于CPC復(fù)合組及RBX組，其與CPC復(fù)合組相比較，具有顯著性差異（P＜0.05）。但在14天時，F(xiàn)G復(fù)合組ALP酶活性顯著低于CPC復(fù)合組、RBX組及對照組（P＜0.05），且與7天時本組細胞ALP酶活性比較無顯著性差異（P＞0.05），而CPC復(fù)合組及RBX組ALP酶活性均顯著高于7天時本組細胞的ALP酶活性（P＜0.05）。14天時，各組細胞均檢測到了I型膠原

10、的表達，其中RBX組細胞的I型膠原表達水平要高于其他各組（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明，三種復(fù)合材料中，具有良好生物降解性、多孔隙率的RBX不僅可明顯促進BMSC成骨表型的表達，而且促進了細胞的增殖。FG復(fù)合組與CPC復(fù)合組相比較，F(xiàn)G自身由于降解過快，導(dǎo)致BMP流失過早，使得誘導(dǎo)BMSC數(shù)量有限。CPC盡管降解緩慢，卻可達到持續(xù)誘導(dǎo)干細胞的作用，但其釋放BMP的速度仍顯緩慢，有待進一步改善。
　　3、兩種注射型生物材料復(fù)合BMP

11、對兔前交叉韌帶重建術(shù)后腱-骨間愈合影響的實驗研究
　　分別選取注射型纖維蛋白膠（FG）及注射型磷酸鈣骨水泥(CPC)復(fù)合牛bBMP構(gòu)建注射型生物材料，應(yīng)用于兔前交叉韌帶重建手術(shù)，在體觀察它們對骨隧道內(nèi)的骨生長及移植肌腱與骨隧道之間愈合的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)G復(fù)合材料及CPC復(fù)合材料均可促進腱-骨間新生骨的生長。術(shù)后6周，兩組標(biāo)本腱-骨間骨礦化組織密度（BMD）均明顯高于對照組，F(xiàn)G復(fù)合組BMD值高于CPC復(fù)合組，但二者無顯著性差異；

12、術(shù)后12周，CPC復(fù)合材料組腱骨間的BMD值最高，但兩組材料組與對照組相比均無顯著性差異。實驗還發(fā)現(xiàn)，由于二者在體內(nèi)生物降解率的不同，F(xiàn)G復(fù)合材料組腱-骨間新生骨的生成具有爆發(fā)效應(yīng)，6周達到最高，12周趨于穩(wěn)定，而CPC復(fù)合材料組腱-骨間新生骨的生成則呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，至12周時，仍有新骨形成。但兩組腱-骨間均未見形成類似于原ACL正常止點的直接連接，而都形成了以Sharpey樣纖維膠原連接為主的間接連接。生物力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，由于CPC

13、降解較慢，所以6周時它自身與骨隧道之間的把持力及新生骨的共同作用，使得其最大牽拉力明顯高于FG復(fù)合組及對照組，但至12周時，最大牽拉力盡管仍大于FG復(fù)合組，但已無明顯性差異。上述結(jié)果顯示CPC的BMP釋放效率有待改善。
　　4、多孔性三維結(jié)構(gòu)生物材料與注射型支架材料分別復(fù)合BMP對前交叉韌帶重建術(shù)后腱-骨間愈合影響的比較研究
　　本實驗采用具有三維立體多孔隙結(jié)構(gòu)、集骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性為一體且在臨床應(yīng)用已取得良好效果的重組合異

14、種骨（RBX）來促進腱-骨愈合。Micro-CT結(jié)果顯示，術(shù)后6、12周RBX組腱-骨之間的骨礦化組織密度（BMD）數(shù)值均高于對照組，并具有顯著性差異(p<0.05)。組織學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后2周，RBX組腱-骨之間被大面積不規(guī)則分布的軟骨樣細胞填充；術(shù)后6周，RBX組的腱-骨之間已見大量成熟軟骨細胞，并開始分泌基質(zhì)，而對照組術(shù)后腱-骨間一直被纖維樣結(jié)締組織連接，至術(shù)后12周，RBX組部分標(biāo)本出現(xiàn)類ACL正常肌腱止點。生物力學(xué)結(jié)果同樣證實，

15、RBX組的最大牽拉力均顯著高于對照組。因此應(yīng)用RBX可以顯著提高ACL重建術(shù)后腱-骨間愈合。
　　但仍不清楚不同特性三種載體材料復(fù)合BMP后是否對促進早期腱-骨間生物愈合具有不同影響。本實驗在實驗一、二及三的基礎(chǔ)上，對三種復(fù)合生物材料促進腱-骨間愈合進行了對比研究。借助組織學(xué)觀察、生物力學(xué)檢測、Micro-CT等分析方法，發(fā)現(xiàn)具有三維立體結(jié)構(gòu)多孔隙的固態(tài)支架載體RBX負載BMP后不僅可以為ACL重建提供初始的協(xié)同固定作用，而且對于