原發(fā)性醛固酮增多癥KCNJ5基因突變及蛋白表達的研究.pdf

1、第一部分，原發(fā)性醛固酮增多癥KCNJ5基因突變的研究
　　 目的：
　　 原發(fā)性醛固酮增多癥（原醛癥）是一組以醛固酮分泌增多，腎素-血管緊張素系統(tǒng)受抑制但不受鈉負荷調節(jié)為特點的疾病。2011年Lifton等首次報告36.4％的散發(fā)性醛固酮分泌瘤患者有KCNJ5基因的體系突變。該研究立刻引起了全球廣大內(nèi)分泌醫(yī)師的廣泛關注，但我國國內(nèi)目前尚未見相關報道。
　　 本研究采用PCR測序的方法檢測KCNJ5基因在原醛癥不同

2、分型即醛固酮分泌瘤(APA)、特發(fā)性醛固酮增多癥(IHA)、家族性醛固酮增多癥(FH)及皮質醇分泌瘤(CPA)、嗜鉻細胞瘤(PCC)中的突變情況，并分析基因型與臨床表現(xiàn)型的關系，初步探討KCNJ5基因在腎上腺皮質疾病中的作用。
　　 方法：
　　 1、提取APA(n=48)、IHA的腎上腺結節(jié)樣增生(NH，n=9)、CPA(n=5)、PCC(n=5)患者組織的總DNA及RNA;提取相應的APA(n=12)及IHA腎上腺結

3、節(jié)樣增生(n=3)患者外周血DNA作為對照；另提取IHA(n=10)、FH(n=4)患者的外周血DNA;
　　 2、DNA經(jīng)PCR擴增KCNJ5基因后正反向測序，再將相應的RNA逆轉錄為cDNA后行PCR擴增KCNJ5基因正向測序，檢測上述不同組織中KCNJ5基因的序列；
　　 3、分析KCNJ5基因不同突變型與臨床表現(xiàn)型之間的關系。
　　 結果：
　　 1、原醛癥患者的KCNJ5基因突變
　　

4、1)54.2%的APA患者（25/48例）的腫瘤組織中存在p．G15IR或p．L168R的雜合突變，而與其相匹配的12例患者外周血的基因測序正常；
　　 2)25例突變中48%(n=12)為p．G151R突變,52%(n=13)為p．L168R突變；p.G151R突變分別為c.451G＞A(n=10)或c.451G＞C(n=2)；而p.L168R均為c.503T＞G；
　　 3)1例APA患者（1/48例）存在缺失突變，

5、即157位的異亮氨酸(Ile)缺失，為p.157delI或c.469-471delATC;
　　 4)1例APA患者（1/48例）存在插入突變，即在148位氨基酸后插入蘇氨酸(Thr)，為p.148dupT或c．444-445insAAC;該突變目前國內(nèi)、外尚未見報道；
　　 5)IHA結節(jié)樣增生組織中2例(2/9例)為p.G15IR（均為c.451G＞C）雜合突變,3例（3/9例）為p.L168R雜合突變。
　　

6、 2、原醛癥中KCNJ5基因突變患者的臨床表型
　　 1)KCNJ5基因突變型組與非突變型組APA患者的臨床表型區(qū)別
　　 KCNJ5突變型組較非突變型組有較低的BMI（P＜0.01）、較長的低血鉀病史（P＜0.01=和明顯低的血鉀水平（P＜0.01）；在平衡了年齡及性別因素后，突變型組患者的臥、立位醛固酮水平及ARR仍高于非突變型組（P＜0.05=、卡托普利試驗的醛固酮抑制率明顯低于非突變型組（P＜0.05）；盡管服

7、用高劑量螺內(nèi)酯治療，突變型組患者仍有較高的血壓水平（P＜0.01）。而對血管緊張素II的反應、腫瘤直徑、性別、高血壓病史等在突變型組和非突變型組患者間無差異；腫瘤切除后兩組患者的血鉀均恢復正常，但突變型組患者術后的血壓水平仍高于非突變型組（P＜0.05）。
　　 2)KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突變型組APA患者的臨床表型
　　 KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突變型組APA患者之間的年齡、B

8、MI、高血壓和低血鉀病史、血壓、醛固酮水平、瘤體直徑等均無差異；但p.G151R突變型組患者較非突變型組的BMI較低（P＜0.05）、低鉀血癥病程較長（P＜0.05=，血鉀水平較低（P＜0.01=、血壓較高（P＜0.05=、臥立位醛固酮水平及術后的舒張壓較高（P＜0.05=；而p．L168R突變型組較非突變型組患者年輕（P＜0.05=、BMI較低（P＜0.05=、低血鉀病程更長（P＜0.05=、血鉀水平較低（P＜0.01=、血壓較高（P

9、＜0.01）、ARR水平較高（P＜0.05）及卡托普利對醛固酮的抑制率較低（P＜0.05）。
　　 3)KCNJ5基因突變型組的IHA腎上腺結節(jié)樣增生患者的臨床表現(xiàn)與非突變型組比較無統(tǒng)計學差異；但IHA結節(jié)樣增生突變型組患者比APA突變型患者的卡托普利對醛固酮的抑制率高（P＜0.05）。
　　 3、原醛癥患者KCNJ5基因的單核苷酸多態(tài)性
　　 與SNP數(shù)據(jù)庫資料比較，APA患者KCNJ5基因突變的SNP基因型未

10、顯示有統(tǒng)計學差異(P＞0.1)。
　　 結論：
　　 1、我們的結果顯示：散發(fā)性APA患者的KCNJ5基因的體系突變發(fā)生率為56.3%（27/48例），此突變率高于歐洲（34%，129/380例）[1]、澳大利亞(38%，10/27例)、英國（44%，20/46例）[2]而接近日本（65.20%，15/23例）[3]。提示KCNJ5基因突變率有種族差異。
　　 2、散發(fā)性IHA結節(jié)樣增生患者中也存在KCNJ5基因

11、的體系突變，但結節(jié)周邊組織未顯示KCNJ5基因突變。因例數(shù)較少，故尚需增加例數(shù)來做進一步研究。
　　 3、CPA及PCC患者中未見KCNJ5基因的突變。
　　 4、KCNJ5基因的p.G151R和p.L168R突變，導致APA患者的不同臨床表現(xiàn)，提示KCNJ5基因突變在散發(fā)性APA患者疾病發(fā)生中有重要作用。
　　 5、本研究人群中檢測到p.L168R、p．G151R、p.del157I和p.148dupT四種KC

12、NJ5基因突變類型，其中p.148dupT突變型目前未見國內(nèi)外文獻報道。
　　 第二部分，原發(fā)性醛固酮增多癥中KCNJ5蛋白的表達
　　 目的：
　　 第一部分研究檢測了原醛腺瘤中KCNJ5基因的突變情況及與臨床表現(xiàn)的關系，本部分進一步從蛋白水平探討KCNJ5蛋白的表達在腎上腺皮質疾病中的作用，并分析KCNJ5基因突變型組與非突變型組之間在表達水平上的異同。
　　 方法：
　　 1、提取正常腎上腺

13、皮質(n=8)，原醛癥(n=43)包括醛固酮分泌瘤(APA，n=38)和結節(jié)樣增生(NH，n=5)，腎上腺皮質醇分泌瘤(CPA，n=7)，嗜鉻細胞瘤(PCC，n=6)組織的總蛋白，并測定蛋白濃度。
　　 2、Westernblot方法檢測上述不同組織中KCNJ5蛋白和內(nèi)參GAPDH蛋白的表達；分析目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值，對KCNJ5蛋白的表達進行半定量分析。
　　 3、比較KCNJ5基因突變型組與非突變型組組織中

14、KCNJ5蛋白表達的差異，并結合KCNJ5蛋白表達水平與相應患者的臨床資料行相關性分析。
　　 結果：
　　 1、KCNJ5蛋白的表達
　　 1)KCNJ5蛋白的表達在正常腎上腺皮質均高于原醛腺瘤、腎上腺皮質結節(jié)樣增生和腎上腺皮質醇分泌瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；
　　 2)醛固酮分泌瘤中非突變型組均高于突變型組、腎上腺皮質結節(jié)樣增生組、腎上腺皮質醇分泌瘤和嗜鉻細胞瘤(P＜0.05)；
　

15、　 3)醛固酮分泌瘤p.G151R突變型組和p.L168R突變型組之間KCNJ5蛋白表達量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；
　　 4)嗜鉻細胞瘤組織表達KCNJ5蛋白，其表達量和皮質醇分泌瘤之間無差異（P＞0.05）。
　　 2、KCNJ5蛋白表達量與KCNJ5基因突變
　　 KCNJ5蛋白表達量與KCNJ5基因突變與否呈正相關，r=0.516，P=0.005。
　　 3、KCNJ5蛋白表達量與APA患者

16、臨床表型間的關系
　　 KCNJ5蛋白表達量與KCNJ5突變的APA患者臨床表現(xiàn)型無明顯相關；與無KCNJ5突變的APA患者的臨床表現(xiàn)型亦無明顯相關。
　　 結論：
　　 1、KCNJ5蛋白在原醛癥患者組織中表達低于正常腎上腺，其中KCNJ5基因突變者組織中表達更低，提示KCNJ5基因突變與其蛋白表達下降有關。
　　 2、KCNJ5蛋白的表達與APA患者的臨床表現(xiàn)型無相關。
　　 3、KCNJ5蛋