創(chuàng)作性腦損傷的基礎研究及相關腦脊液漏的臨床治療.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全世界死亡和傷殘的首要原因。顱腦創(chuàng)傷所導致的腦代謝紊亂是嚴重威脅生命的重要原因，對其進行廣泛而深入的研究有著重要的現實意義。事實上目前許多常用的模型與人類所發(fā)生的外傷在受力與外部條件上是有差別的。實驗模型常常應用頭部固定打擊，開顱手術后打擊，延長麻醉時間等方法，這些都會對顱腦損傷的發(fā)展產生影響，減少繼發(fā)性損傷，限制了顱內壓(ICP)的監(jiān)測。我們目前制作了一種新的加速打擊腦外傷小鼠模型，稱為打擊運動模型。此模型不需

2、長時間麻醉，不用限制頭部運動，無需開顱手術，可以進行顱內壓監(jiān)測。損傷的嚴重程度可以通過氣動沖擊力來嚴格控制，設置不同的壓力可以產生高度一致的輕微、中度或重度顱腦損傷。通過觀察不同損傷程度的特征性病理組織學改變和行為缺陷，我們發(fā)現輕度腦外傷后動物表現出廣泛的皮質和皮質下膠質細胞增生。雖然沒有證據顯示明確的皮質中斷，血腦屏障開放，顱內壓的變化或任何可察覺的認知障礙，但是相比中重度腦外傷模型，輕度腦外傷動物表現出的短暫的腦白質萎縮，彌漫性軸索

3、損傷和神經元減少。并且輕度腦損傷出現一定程度的慢性感覺障礙伴隨彌漫性神經損傷，這一結果強調了打擊運動模型與目前現有的腦損傷模型相比有很大的進步，它使得我們可以對不同損傷程度的腦外傷(TBI)模型通過病理生理的研究進行有效評估。同時顱腦外傷后腦脊液漏臨床十分常見，我們對顱腦外傷后造成的腦脊液漏進行引流途徑的研究并通過對額竇骨折造成的腦脊液鼻漏應用新的方法進行有效的臨床治療。
　　 第一部分，創(chuàng)傷性腦損傷后小鼠腦白質變性、神經元缺失

4、及行為學變化的研究
　　 目的:
　　 建立小鼠輕度，中度或重度顱腦創(chuàng)傷實驗模型，對損傷后腦組織進行組織學及行為學改變進行分析研究。評估腦損傷后腦組織及血腦屏障破壞程度，神經元缺失及軸突變性，并對損傷后小鼠行為學改變進行分析研究。
　　 方法:
　　 所有實驗中均采用雄性C57BL/6小鼠，乙醚誘導麻醉后應用改良控制性皮質損傷設備(CCI)造成大腦創(chuàng)傷，采用不同的打擊速度制作不同程度的腦創(chuàng)傷模型，輕度4.

5、8米/秒，中度5.2米/秒和重度5.6米/秒。應用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色評價TBI后腦損傷的體積;伊文氏藍外滲技術評估血腦屏障破壞程度;免疫組化染色觀察創(chuàng)傷后腦部不同部位星形膠質細胞，微小膠質細胞，髓鞘堿性蛋白，磷酸化神經纖維，神經元的變化;干重-濕重法評估腦水腫的演變過程;并對顱內壓及腦電活動進行監(jiān)測，進行一系列行為學測試。
　　 結果:
　　 1、打擊運動顱腦損傷模型的成功建立
　　 打擊

6、運動顱腦損傷模型首先的特點在于可以造成三種不同嚴重程度的損傷。僅需乙醚誘導麻醉后，迅速完成打擊過程（平均19.9±1.9秒，17-24秒，N=26）。輕度腦外傷動物的覺醒時間與對照組動物沒有顯著差異，而中度和重度腦外傷動物表現出明顯的蘇醒延遲（P＜0.01）。輕度到重度運動打擊模型從麻醉到蘇醒的整體時間范圍為4.5-6.5分鐘。未發(fā)現有造模過程導致急性死亡。366只小鼠造模共有16只死亡，其中輕度1只，中度1只，重度14只。
　　

7、 2、損傷后不同程度組織破壞及血腦屏障的改變
　　 2.1、重度損傷組發(fā)現10.8％(16/148)有明顯凹陷性顱骨骨折，但在輕度或中等損傷組沒有觀察到顱骨骨折。中度和重度組發(fā)現同側硬膜下和/或蛛網膜下腔出血、明顯挫傷，往往累積深部皮層及相關腦白質。
　　 2.2、腦外傷24小時后伊文氏藍染色，輕度損傷組并沒有表現出明顯的損傷，而中度損傷只表現在小的損傷灶。相比輕度和中度損傷，重度腦外傷導致顯著的大范圍組織損傷與缺失，

8、占對側半球的體積近75％。
　　 3、損傷后反應性膠質細胞的演變
　　 輕度腦外傷動物，彌漫GFAP和CD68免疫標記僅在局部受損傷一側表達，穿透深度的皮質，皮質下白質，涉及紋狀體，活化的小膠質細胞與反應性星形膠質細胞區(qū)域重疊，但一般僅限于皮層表面。3天后輕度膠質細胞增生并在第7天達到高峰。14天仍有表達，但在TBI后28天大部分消失。輕度腦外傷動物在任何時間點未發(fā)現明顯膠質瘢痕或對側腦損傷。重度腦外傷與中度的傷害相類似

9、，但范圍更加廣泛，涵蓋了同側皮質，皮質下白質，紋狀體和海馬前部。對沖性損傷也明顯位于皮質紋狀體且范圍更大。
　　 4、損傷后神經元缺失和軸突變性
　　 4.1、NeuN缺失輕度損傷后在任何時間點沒有發(fā)現皮質或皮質下體積改變。中度損傷后，皮層組織中神經元第7天開始減少。輕度損傷組在內的所有不同程度腦損傷在3天和7天均有明顯的神經元缺失，但不同損傷等級之間并沒有統(tǒng)計學差異。重型顱腦損傷的動物除了組織的破壞和萎縮外，類似的損失

10、是顯而易見的，并且不同損傷組均有著劑量依賴性。
　　 4.2、免疫標記磷酸化神經絲(SMI-34)，傷后14天通過對免疫磷酸化神經纖維(SMI-34)的觀察分析發(fā)現同側皮質和皮層下白質存在軸突變性。中度頭部外傷后軸突變性更廣泛，輕度腦外傷動物也可以觀察到。
　　 4.3、髓鞘堿性蛋白(MBP)在中度腦外傷后14天GFAP陽性免疫反應周邊區(qū)域，MBP在皮質的表達較對側鏡像區(qū)相對中斷和不連續(xù)，重度損傷后14天皮質脫髓鞘更加嚴

11、重。
　　 5、腦水腫輕度損傷模型在任何時間點均未發(fā)現腦水腫。相比之下，重度損傷模型腦組織同側和對側半球含水量在1和3天顯著升高，而中度損傷后只在同側半球有顯著升高。對側并沒有表現出顯著的腦水腫。在腦外傷7天后，重型顱腦損傷的對側和中型顱腦損傷的同側腦水腫均消退，但重型顱腦損傷動物的同側仍升高。
　　 6、顱內壓(ICP)中度損傷后ICP迅速增加并在傷后3天達到頂峰。除了ICP峰值和谷值均相對增高外，受傷后1天ICP脈搏

12、波振幅也顯著升高。基本在傷后4-6天回復正常水平。
　　 7、外傷后癲癇發(fā)作的評價腦電活動在更高的頻段上沒有明顯改變，沒有檢測到創(chuàng)傷后癲癇樣活動，且在發(fā)生在尖峰內的癲癇樣活性增強沒有統(tǒng)計學意義。
　　 8、行為學評估
　　 8.1、神經學評分
　　 模型組在傷后3小時后表現出顯著的神經功能損傷，中度和輕度損傷相對重度損傷分數要高，輕度腦外傷動物恢復快，24小時后基本恢復正常水平，中度在3天之間恢復，重型顱

13、腦損傷的動物傷后3至7天逐漸恢復。
　　 8.2、旋轉試驗（Rotarodtest）對照組動物協(xié)調性有明顯提高，反映除了運動學習性能外完整的運動協(xié)調性。相比之下，中/重度TBI動物未能改善，一周后表現出持續(xù)的運動功能缺陷。
　　 8.3、曠場試驗對照組與各模型組無統(tǒng)計學意義。從而說明了在創(chuàng)傷性腦外傷中旋轉實驗反應了受損的運動學習功能而不是簡單的運動缺陷。
　　 8.4、新奇物識別實驗在全程五周實驗中對照組動物表現

14、出穩(wěn)定的對新物體的識別，輕度損傷表現正常，然而中度/重度TBI動物表現出對新事物辨識顯著和持續(xù)的下降。
　　 8.5、巴恩斯迷宮(Barnesmaze)實驗腦外傷28天后。在連續(xù)3天的實驗，對照組小鼠完成實驗的時間明顯縮短。輕度損傷小鼠與對照組相比無明顯差別，然而中度/重度腦外傷小鼠表現出明顯的認知障礙(P＜0.05)。此外，與新奇物識別實驗測試結果一致，輕度腦外傷動物沒有表現出任何的認知缺陷，中度和重度TBI表現出長期運動和認

15、知功能障礙。
　　 結論:
　　 新TBI模型具有以下特點:(1)小鼠在受到打擊后頭部和身體可以自由運動，受力機制類似于現實生活中的意外傷害。(2)無需進行任何造模前的手術準備;(3)小鼠只需2-3min的誘導麻醉;(4)顱骨仍然閉合，避免顱骨骨折;(5)損傷程度可控性，包括輕度腦損傷特點:廣泛的膠質細胞增生和腦白質變性。總體而言，這種簡單的模型以造成穩(wěn)定的腦白質病變伴隨神經元的缺失，對不同程度損傷后的腦代謝改變的深入研

16、究有重要意義，將對神經保護性試驗研究產生十分有利的作用。
　　 第二部分，創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后水通道蛋白(AQP4)功能失調的動態(tài)改變及星形膠質細胞反應區(qū)域AQP4表達的復雜變化
　　 目的:
　　 研究輕度及中度顱腦損傷后AQP4的動態(tài)改變和星形膠質細胞反應區(qū)域AQP4表達的復雜變化。
　　 方法:
　　 10-12周齡的雄性C57BL/6小鼠，應用改良控制性皮層打擊設備造模，通過免疫組化染

17、色分析膠質纖維酸性蛋白（GFAP），小膠質細胞(CD68)，神經元標記物(NeuN)，神經絲蛋白磷酸化標記物(SMI-34)，水通道4(AQP4)和髓鞘堿性蛋白(MBP)損傷后的變化。
　　 結果:
　　 1、輕、中度顱腦創(chuàng)傷模型的建立'輕度'和'中度'的腦損傷皮質撞擊速度為4.8米/秒和5.2米/秒，深度和接觸時間均保持不變（見第一部分）。
　　 2、創(chuàng)傷后膠質細胞反應性改變
　　 輕度腦外傷動物3天傷

18、后，打擊部位星形膠質細胞(GFAP)和小膠質細胞(CD68)彌漫反應性增生(Fig.1B)。輕度腦外傷動物在任何時間點沒有明顯的膠質瘢痕出現，皮質改變在中度損傷后3天明顯7天達到高峰，在7天形成明確的膠質瘢痕。
　　 3、TBI后脫髓鞘和軸突變性
　　 輕度損傷在任何時間點沒有發(fā)現明顯的皮質或皮質下體積改變(Fig.2A-B)，中度損傷后，皮層組織在傷后第7天出現改變(Fig.2A*P＜0.05比對照)。輕度和中度頭部外

19、傷，包括胼胝體，外囊，皮質下白質有短暫的萎縮，在傷后第7天達到高峰（Fig.2C*P＜0.05vs.對照）在14天趨于穩(wěn)定。在膠質原纖維酸性蛋白免疫反應性的中度病變周圍的區(qū)域，MBP較對側表達明顯減弱。（Fig.2D-F;*P＜0.05vs.對照組）。磷酸化神經纖維(SMI-34)在傷后14天出現同側皮質和皮質下白質軸突變性。輕度損傷也出現廣泛軸突變性，但中度損傷更為明顯(Fig.2I)。
　　 4、顱腦損傷后AQP4在局部的皮

20、層和紋狀體的表達發(fā)生復雜的變化。輕度損傷中AQP4在全腦的表達與血管周圍AQP4表達均有明顯減少。損傷后7天膠質瘢痕的形成使得AQP4上調表達增加，且AQP4的表達失調與星形膠質細胞反應性改變有關。
　　 結論:
　　 創(chuàng)傷后反應性星形膠質細胞AQP4表達表現出明顯的去極化，AQP4失調可能并不導致創(chuàng)傷后腦水腫和ICP的變化發(fā)展，而可能是一種代償性反應。從輕度顱腦損傷后反應性星形膠質形成伴隨AQP4功能失調來看，可以針對

21、膠質細胞增生的治療途徑使AQP4表達正常化，減少中度或重度腦外傷創(chuàng)傷后癲癇發(fā)作的易感性，有利于腦內代謝廢物的清除。
　　 第三部分，顱腦損傷后(TBI)腦脊液漏的基礎研究及臨床治療
　　 目的:
　　 對顱腦外傷后造成腦脊液漏進行引流途徑研究并對額竇骨折造成的腦脊液鼻漏通過經皮注射纖維蛋白膠治療的方法進行臨床評估。
　　 方法:
　　 影像學分析額竇鼻腔開口及其解剖學相關引流途徑，對目前顱腦創(chuàng)傷所

22、導致的難治性腦脊液鼻漏進行影像學定位診斷，并分析經皮注射纖維蛋白膠治療額竇骨折腦脊液鼻漏的方法進行圍手術期觀察及預后的評估。
　　 結果:
　　 對顱腦創(chuàng)傷導致額竇腦脊液鼻漏的基礎研究有助于發(fā)現新的治療途徑。經皮穿刺注射纖維蛋白膠是有效治療額竇腦脊液鼻漏的新方法。手術時間為27.6±7.98分鐘，平均住院為11.25±4.99天，隨訪平均為11.5個月未見復發(fā)。
　　 結論:
　　 對顱腦創(chuàng)傷導致額竇腦脊