不同齲深狀態(tài)下人成牙質(zhì)細(xì)胞的凋亡及凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá).pdf

1、目的:細(xì)胞凋亡（apoptosis）也稱程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，是指在凋亡信號(hào)刺激下，機(jī)體為維護(hù)其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡過程。凋亡發(fā)生在生命個(gè)體的生長、發(fā)育、成熟和衰老各個(gè)階段，具有非常重要的意義，一直是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在細(xì)胞凋亡的研究過程中，發(fā)現(xiàn)bcl-2家族基因在其中起著重要的作用，典型的有抗凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax。研究表明，bcl-2基因的抗凋亡作

2、用和bax基因的促凋亡作用是通過二者在組織細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白量來完成的，Bcl-2/Bax蛋白比值調(diào)控著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。
　　 牙髓組織和身體其他組織一樣，都存在著細(xì)胞凋亡。成牙本質(zhì)細(xì)胞(odontoblast)是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的特征性細(xì)胞，它的細(xì)胞突起伸入到牙本質(zhì)中，是牙髓內(nèi)最早接觸外來損傷刺激的細(xì)胞。許多研究表明，齲病進(jìn)展到牙本質(zhì)以后，牙髓會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變，包括細(xì)胞凋亡和修復(fù)性牙本質(zhì)形成。但不同的報(bào)道之間存在較大差異，

3、目前缺乏隨病變進(jìn)展的動(dòng)態(tài)及定量研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過HE染色、TUNEL染色和凋亡蛋白Bcl-2、Bax免疫組織化學(xué)染色對(duì)人離體牙標(biāo)本進(jìn)行研究，進(jìn)而探討齲病進(jìn)展中成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡機(jī)制，以及凋亡與成牙本質(zhì)細(xì)胞損傷修復(fù)動(dòng)態(tài)變化的可能關(guān)系。
　　 方法:
　　 1標(biāo)本選擇與制備:經(jīng)患者知情同意，選牙根發(fā)育完成且可完整拔除，患不同程度齲病但無治療與保留價(jià)值的第三磨牙?；颊吣挲g20～40歲，無系統(tǒng)性疾病，牙體已萌出且無

4、充填物、無明顯磨耗和磨損、無牙周病患。拔牙前記錄病史、臨床癥狀、牙髓活力值及X線結(jié)果，且病損均為慢性齲，發(fā)生于(拾)面。參照《牙體牙髓病學(xué)》慢性齲診斷標(biāo)準(zhǔn)和齲病深度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將其分為正常牙組、淺齲組、中齲組和深齲組，每組20顆。拔除后即刻截根，標(biāo)記病損部位，固定脫鈣，分切沖洗，石蠟包埋，2.5μm切片。
　　 2HE染色:觀察髓頂中部或齲損部位下方有無修復(fù)性牙本質(zhì)形成，計(jì)數(shù)成牙本質(zhì)細(xì)胞。
　　 3TUNEL染色:觀察成牙本

5、質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況，計(jì)算其凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）。棕黃色或褐色胞核的細(xì)胞為陽性，即凋亡細(xì)胞，藍(lán)色胞核的細(xì)胞為陰性。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。
　　 4免疫組織化學(xué)染色:觀察蛋白Bcl-2和Bax在成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。Moticmedical6.0圖像分析系統(tǒng)定量灰度值。
　　 5SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1HE染色結(jié)果
　　

6、1.1正常牙組:髓頂中部下方牙髓分層清楚，乏細(xì)胞層和多細(xì)胞層明顯。成牙本質(zhì)細(xì)胞高柱狀，胞漿豐富，高倍鏡下成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約為15.42個(gè)/100μm。未發(fā)現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.2淺齲組:齲損部位下方牙髓分層清楚，乏細(xì)胞層和多細(xì)胞層明顯。成牙本質(zhì)細(xì)胞高柱狀，胞漿豐富，高倍鏡下成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約為15.71個(gè)/100μm。未發(fā)現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.3中齲組:大部分齲損部位下方牙髓無明顯分層，乏細(xì)胞層消失，

7、有修復(fù)性牙本質(zhì)形成。修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞矮柱狀或立方狀，胞漿較少，高倍鏡下成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約為9.91個(gè)/100μm。其他部位的成牙本質(zhì)細(xì)胞類似于正常牙組且無修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.4深齲組:齲損部位下方牙髓無明顯分層，乏細(xì)胞層消失，均有較厚修復(fù)性牙本質(zhì)形成。修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞立方狀或扁平狀，胞漿少，高倍鏡下成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約為6.41個(gè)/100μm。其他部位的成牙本質(zhì)細(xì)胞類似于正常牙組且無修復(fù)性牙本

8、質(zhì)形成。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間的成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2TUNEL染色
　　 2.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細(xì)胞層的凋亡指數(shù)約為0.20。
　　 2.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞層的凋亡指數(shù)約為0.21。
　　 2.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞層的凋亡指數(shù)約為28.65。
　　 2.4深齲組:

9、齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞層的凋亡指數(shù)約為52.68。
　　 使用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3免疫組織化學(xué)染色
　　 3.1凋亡蛋白Bcl-2
　　 3.1.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為198.00。
　　 3.1.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿淺黃色

10、，灰度值約為197.93。
　　 3.1.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿黃色，灰度值約為178.98。
　　 3.1.4深齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿棕黃色，灰度值約為151.40。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.2凋亡蛋白Bax
　　 3.2.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細(xì)

11、胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為196.23。
　　 3.2.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為195.24。
　　 3.2.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿棕黃色，灰度值約為150.53。
　　 3.2.4深齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細(xì)胞胞核未著色，胞漿棕褐色，灰度值約為117.51。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間

12、比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1齲損局限于釉質(zhì)時(shí)，成牙本質(zhì)細(xì)胞無明顯凋亡;齲損發(fā)展到牙本質(zhì)以后，成牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨著齲病的進(jìn)展而逐步增多。對(duì)淺齲、中齲和深齲組的凋亡指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡與修復(fù)性牙本質(zhì)的形成可能存在一定關(guān)系。
　　 2正常牙組和淺齲組抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平均較低，中齲組和深齲組兩