活性氧在藍(lán)萼甲、乙和丙素對(duì)萵苣的化感調(diào)節(jié)和HL-60細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、藍(lán)萼香茶菜（Rabdosia japonica(Burm. f.) Hara var. glaucocalyx(Maxim.) Hara）為唇形科（Labiatae）香茶菜屬多年生落葉植物，廣泛分布于中國東北等地。香茶菜屬植物富含的對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物會(huì)隨著植株枯萎被釋放到土壤中，對(duì)其他植物的生長產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用（化感作用或他感作用，allelopathy）。許多單萜和倍半萜化合物被證實(shí)為化感節(jié)物質(zhì)，藍(lán)萼香茶菜含有豐富的貝殼杉烷二

2、萜次生代謝產(chǎn)物如藍(lán)萼甲素（Gla A）、藍(lán)萼乙素（Gla B）和藍(lán)萼丙素（Gla C），它們是否具有強(qiáng)烈的化感作用，以及在其自然生境中是否發(fā)揮重要的生態(tài)作用？目前尚無相關(guān)報(bào)道。另一方面，藍(lán)萼香茶菜全草入藥，具有抗菌、調(diào)節(jié)心肌血流量、抗腫瘤活性。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究已表明：Gla A可誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡，活性氧（ROS）參與了線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但對(duì)ROS來源及其調(diào)節(jié)方式的研究還未見報(bào)道。本研究分別以萵苣（Lactuca

3、sativa L.）和HL-60細(xì)胞為對(duì)象，探討Gla A、Gla B和Gla C的化感作用和凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，挖掘?qū)τ?貝殼杉烷二萜化合物誘導(dǎo)的ROS作為植物生長調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞凋亡中的信號(hào)意義，為深入了解藍(lán)萼香茶菜的化學(xué)生態(tài)學(xué)意義和抗腫瘤藥學(xué)應(yīng)用提供理論參考和依據(jù)。
　　本論文已成功完成以下四部分內(nèi)容：
　　一、Gla A-C的化感作用研究初探
　　我們測定了Gla A-C對(duì)萵苣種子萌發(fā)和幼苗凈生長率的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的

4、Gla A（20-40μM）和Gla B（20μM）對(duì)萵苣根的生長具有促進(jìn)作用，Gla A（40μM）和Gla B（20μM）作用萵苣幼苗48h后，與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞長度分別增加了17.34%和14.48%，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（MI）分別提高了21.59%和28.04%。高濃度（80-200μM）的Gla A、B對(duì)萵苣根的生長具有抑制作用，200μM的Gla A、B作用萵苣幼苗48 h后，與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞長度分別下降了35.

5、03%和38.54%， MI分別下降了30.98%和40.34%。另外，20-200μM的Gla A處理48h后，與對(duì)照組相比，萵苣根毛長度的下降率為23.39-96.95%，根毛密度的下降率為26.15-86.15%。Gla B處理組中萵苣根毛長度的下降率為15.76-96.71%，根毛密度的下降率為3.46-91.15%，說明Gla A、B對(duì)萵苣根毛發(fā)育的抑制作用在20-200μM范圍內(nèi)具有濃度依賴性，而Gla C對(duì)植物均無影響。本

6、研究結(jié)果表明：Gla A、B對(duì)萵苣根的生長具有“低濃度促進(jìn)高濃度抑制”的雙向生長調(diào)節(jié)作用，并且這種調(diào)節(jié)作用是通過影響根細(xì)胞大小和細(xì)胞有絲分裂速率來實(shí)現(xiàn)的。
　　二、Gla A、B誘導(dǎo)的活性氧與化感作用的關(guān)系研究
　　Gla A、B（20-200μM）處理萵苣3h，萵苣根中萵苣中超氧陰離子（O2-×）分別比對(duì)照的增加1.10-1.55倍和1.11-1.65倍，而Gla C處理則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生O2-×。200μM的Gla A、B處

7、理48h后，萵苣根中丙二醛（MDA）水平分別上升了50.74%和77.32%，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生氧化壓力。同時(shí)，細(xì)胞中抗氧化酶系如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性顯著提高，200μM的Gla A處理48h后，萵苣根中的這三種酶活性分別上升了33.71%、43.83%和81.37%；Gla B處理組中，萵苣根中的這三種酶活性分別上升了45.37%、60.18%和111.22%，而Gla C處理后不

8、能引起此抗氧化酶系的變化。為了進(jìn)一步證明ROS在Gla A, B誘導(dǎo)的化感抑制中的作用，我們用ROS清除劑鈦鐵試劑（Tiron）和二甲基硫脲（DMTU）（100μM）預(yù)處理萵苣幼苗2h，發(fā)現(xiàn)ROS清除劑能有效緩解Gla A、B對(duì)根的生長抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：ROS可能介導(dǎo)了對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物如Gla A、B的化感抑制作用，該類化合物在植物化感作用中的化學(xué)生態(tài)學(xué)意義值得進(jìn)一步研究。
　　三、Gla A-C誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡

9、
　　Gla A在4h、12h、24h、48h的IC50（半數(shù)抑制率）分別為34.14μM、23.98μM、6.15μM和4.48μM，Gla B在相應(yīng)時(shí)間的IC50分別為30.84μM、18.68μM、5.86μM和3.61μM，Gla A、B對(duì)HL-60的生長抑制具有濃度和時(shí)間依賴性，而Gla C經(jīng)過相應(yīng)處理后不能對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生生長抑制作用。我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定Sub-G1峰表征凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明：2-32μM的Gla

10、 A處理HL-60細(xì)胞24 h后，凋亡率為對(duì)照的1.18-9.74倍，Gla B處理組中，凋亡率為對(duì)照的1.52-10.57倍，而且Gla A、B對(duì)HL-60的凋亡誘導(dǎo)具有濃度依賴性，但在Gla C處理組中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的凋亡現(xiàn)象發(fā)生。另外，Gla A、B能誘導(dǎo)HL-60產(chǎn)生G2/M細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷和ROS積聚，而Gla C處理組中沒有以上作用。本研究表明：Gla A、B能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而與Gla A、B結(jié)構(gòu)相似的G

11、la C不能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。
　　四、活性氧和谷胱甘肽（GSH）在HL-60凋亡誘導(dǎo)中的作用
　　我們應(yīng)用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）作為探針，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞ROS含量，與對(duì)照組相比，32μM的Gla A、B處理HL-60細(xì)胞3h后， ROS上升了6.70和5.64倍，而Gla C不能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。GSH系統(tǒng)在生物體內(nèi)抗氧化和解毒代謝中起著重要作用，我們用1mM的GSH或者GSH前體 N-

12、乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)處理細(xì)胞1 h，能顯著降低Gla A、B造成的細(xì)胞毒害、ROS迸發(fā)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和周期阻滯；而10μM的GSH合成抑制劑丁硫氨酸亞砜胺（BSO）預(yù)處理細(xì)胞12h后，則加劇細(xì)胞的毒害作用。Gla A、B（16-32μM）處理HL-60細(xì)胞24h后，分別使細(xì)胞內(nèi)的GSH含量下降19.92%-44.24%和23.81%-53.95%，而Gla C不能影響細(xì)胞內(nèi)的GSH含量。32μM的Gla A、B處理HL-60細(xì)胞24

13、 h后，谷胱甘肽還原酶（GR）活性分別下降了52.75%、71.02%，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性分別下降了60.47%、67.97%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明：含α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的Gla A、B可能通過直接與GSH反應(yīng)或間接地使酶（GPX、GR）失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降、引發(fā)細(xì)胞ROS迸發(fā)。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Gla A和Gla B是具有植物生長調(diào)節(jié)活性的化感物質(zhì)和HL-60細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)物質(zhì)，首次證明了ROS可以介導(dǎo)