表皮細胞懸液與微粒皮聯(lián)合修復深度創(chuàng)面的基礎研究.pdf

1、目的
　　研究自體表皮細胞懸液與自體微粒皮聯(lián)合修復深度創(chuàng)面的效果,為特大面積深度燒傷創(chuàng)面修復提供實驗基礎。
　　方法
　　1.大鼠表皮細胞分離培養(yǎng)與基因標記
　　(1)用1.25g/L中性蛋白酶消化大鼠背部皮膚,分離表皮,2.5g/L胰蛋白酶消化表皮,體外分離培養(yǎng)原代表皮細胞(epidermis cells,ECs),免疫組織化學法檢測細胞的抗原表達,將原代細胞隨機分為兩組,改良組和傳統(tǒng)組,改良組細胞采用低濃度(

2、0.25g/L胰蛋白酶)消化液消化傳代,傳統(tǒng)組采用傳統(tǒng)濃度(2.5g/L胰蛋白酶)消化液消化傳代,錐蟲藍染色法計數(shù)細胞存活率,噻唑藍比色法檢測貼壁細胞數(shù)量(以吸光度值表示)。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞儀檢測細胞周期,β-半乳糖苷酶染色法計數(shù)衰老細胞比率。
　　(2)利用含RFP基因的慢病毒,以不同感染復數(shù)(MOI值分別為0,5,20,50,100)轉染ECs,熒光顯微鏡下觀察RFP的表達情況,流式細胞儀檢測細胞轉染效率,

3、MTT法評價轉染慢病毒對ECs增殖的影響,確定最佳病毒感染復數(shù)。
　　2.動物模型建立與創(chuàng)面修復
　　(1)動物模型建立:16只成年SD大鼠隨機分為2組,模型組和對照組。每組8只。將大鼠麻醉,刮毛、消毒后,在背部量取3.3cm×3cm(縱長橫短)皮膚范圍,切除標記范圍內的全層皮膚至深筋膜層,形成全層皮膚缺損創(chuàng)面。模型組創(chuàng)面周圍縫合3.3cm×3cm鋼絲圈,對照組不作處理,兩組大鼠創(chuàng)面交叉移植同種異體中厚皮,紗布打包固定。術后

4、7d拆除敷料,并于術后7d、14d、21d使用數(shù)碼相機照相,采用圖像分析軟件(Image J,V1.30)計算兩組大鼠創(chuàng)面收縮率。
　　(2)創(chuàng)面修復:50只成年SD大鼠隨機分成5組,微粒皮(1:10)移植組,微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組、微粒皮(1:20)移植組、細胞懸液移植組、空白組對照組,每組10只。制作大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面抗攣縮模型,將各組移植物分別移植到相應創(chuàng)面,覆蓋異體中厚皮(異體皮來自25只成年Wistar大鼠

5、)。觀察大張異體皮成活情況及脫落時間,用數(shù)碼照相結合圖像分析軟件(Image J,V1.30)測量創(chuàng)面愈合率。于術后14d、21d取組織塊以甲醛固定,制作病理切片,HE染色,免疫組織化學染色檢測Ⅳ型膠原與層黏連蛋白表達。微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組大鼠,表皮細胞熒光標記后移植,使用小動物活體成像技術檢測創(chuàng)面熒光表達。
　　結果
　　1.大鼠表皮細胞分離培養(yǎng)與基因標記
　　(1)消化培養(yǎng)得到的細胞經免疫組織化學染色

6、,表面表達CK19和CK14等表皮細胞標志抗原,證實分離出的細胞為表皮細胞。首次傳代細胞改良組細胞存活率[(94.56±1.74)％]顯著高于傳統(tǒng)組[(66.22±2.57)%, t=15.815, P<0.05];傳代細胞接種1h、12h、24h,改良組貼壁細胞吸光光度值(0.205±0.015,0.225±0.014,0.265±0.021)均顯著高于傳統(tǒng)組(0.176±0.015,0.196±0.011,0.221±0.019,

7、t值分別為2.947,3.517,3.476, P值均小于0.05)。細胞經5次傳代后,鏡下觀察改良組細胞為圓形或小的多角形,或呈鵝卵石樣鋪滿瓶底;傳統(tǒng)組細胞胞體變大,增殖緩慢,呈片狀覆蓋瓶底;改良組S+G2/M期細胞所占百分率[(30.55±2.29)%]顯著高于傳統(tǒng)組[(17.01±5.58)%, t=3.890, P<0.05];改良組衰老細胞比率[(10.87±2.01)%]顯著低于傳統(tǒng)組[(75.93±4.11)%, t=24

8、.624, P<0.05]。
　　(2)顯微鏡下觀察細胞發(fā)現(xiàn),轉染24h后有微弱熒光,48h后熒光增強,72h后熒光更強。當以MOI=5,20,50,100轉染細胞72h后,RFP陽性表達率分別為1.68%,17.15%,47.53%,69.90%;病毒轉染72h后,MOI=0,5,20,50,100各組細胞吸光度值分別為1.14±0.143,1.05±0.073,1.02±0.090,1.03±0.141,0.912±0.102

9、,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=3.022,P<0.05),兩兩比較MOI=0未轉染組和MOI=5組細胞吸光度值高于MOI=100組(P<0.05)。
　　2.動物模型建立與創(chuàng)面修復
　　(1)動物模型建立:術后7d、14d、21d,模型組創(chuàng)面收縮率分別為(1.3±0.5)%,(1.9±0.9)%,(2.6±1.3)%均顯著低于(8.6±1.2)%,(37.4±2.6)%,(65.0±3.7)%(t值分別為15.911,36

10、.581,44.847,P均小于0.05)。
　　(2)創(chuàng)面修復:
　?、俅篌w觀察:術后5d,異體皮顏色紅潤,術后14d異體皮干燥,開始脫落。術后21d異體皮基本脫落,空白組大鼠異體皮脫落時間晚于實驗組。異體皮脫落后,微粒皮(1:10)移植組,微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組、微粒皮(1:20)移植組、細胞懸液移植組創(chuàng)面均可見成片的上皮。大鼠創(chuàng)面愈合率:微粒皮(1:10)移植組創(chuàng)面愈合率為(84.3±11.9)%,微粒皮(

11、1:20)+細胞懸液移植組創(chuàng)面愈合率為(74.2±8.0)%,微粒皮(1:20)移植組創(chuàng)面愈合率為(59.2±10.8)%,細胞懸液移植組創(chuàng)面愈合率為(53.8±11.5)%,空白組創(chuàng)面愈合率為(22.7±5.5)%,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=34.446,P<0.05),兩兩比較,微粒皮(1:10)移植組與微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),均顯著高于微粒皮(1:20)移植組(P<0.05),

12、細胞懸液移植組創(chuàng)面也可愈合但上皮薄,易液化,空白組創(chuàng)面愈合率均顯著低于各實驗組(P<0.05),殘余大部分肉芽創(chuàng)面。
　?、诮M織學觀察:HE染色,鏡下觀察,術后14d,微粒皮(1:10)移植組,微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組、微粒皮(1:20)移植組、細胞懸液移植組新生上皮排擠異體皮,使其與創(chuàng)面部分分離,術后21d,異體皮脫落,微粒皮(1:10)移植組,微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組、微粒皮(1:20)移植組表皮分層明顯,

13、與正常大鼠皮膚表皮相比,表皮層明顯增厚,基底層呈柱狀排列,細胞懸液移植組表皮層含有較多空泡,空白組術后14d異體皮下無上皮細胞層,術后21d,異體皮脫落,可見肉芽組織。微粒皮(1:10)移植組,微粒皮(1:20)+細胞懸液移植組、微粒皮(1:20)移植組表皮-真皮連接層Ⅳ型膠原與層黏連蛋白有表達,細胞懸液移植組、空白組無表達,僅在真皮層新生血管處有部分表達。
　?、坌游锘铙w成像觀察:熒光標記細胞移植,創(chuàng)面有熒光成像。
　　

14、結論
　　1.低濃度胰蛋白酶消化法能減輕細胞損傷,提高細胞活性、增加傳代次數(shù),為實驗研究創(chuàng)造良好條件。
　　2.慢病毒介導的RFP基因能夠表達于大鼠表皮細胞中,轉染效率與MOI值具有量效關系, MOI值為50可作為轉染表皮細胞的合適MOI值。
　　3.大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面創(chuàng)緣縫制鋼絲圈可有效減輕創(chuàng)面攣縮。
　　4.微粒皮與表皮細胞懸液聯(lián)用,可提高創(chuàng)面愈合率,減少裸露創(chuàng)面,該方法可顯著提高自體皮的利用效率,為大面積