清火敗毒飲通過HSP70拮抗燒傷后腸粘膜凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的:在動物體內(nèi)和體外研究清火敗毒飲對燒傷后腸粘膜組織中Hsp70/p-Akt通路表達(dá)水平及凋亡相關(guān)因子Caspase-3的影響，探討上述因素對燒傷后腸粘膜可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:選擇健康SD大鼠136只，隨機(jī)分為正常組（又稱對照組）、單純燒傷組（簡稱燒傷組）、燒傷后QHBDY治療組（簡稱治療組），治療組根據(jù)清火敗毒飲灌喂劑量不同分為0.5ml/100g，1ml/100g，1.5ml/100g三組。于燒傷后6小時，12小時，2

2、4小時以及48小時采集小腸組織標(biāo)本，用TUNEL法分析小腸粘膜組織細(xì)胞的凋亡率，運(yùn)用Real time PCR技術(shù)和IHC技術(shù)檢測腸粘膜組織中Hsp70、Caspase-3的表達(dá)情況。構(gòu)建Hsp70-pZsGreen卜C1真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入IEC-18細(xì)胞，用Western blot的方法觀察轉(zhuǎn)染后12小時，24小時，48小時和72小時Hsp70和p-Akt的表達(dá)情況。用FCM術(shù)檢測Hsp70轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞凋亡率的影響，用Caspa

3、se-3分光光度法檢測Hsp70轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞Caspase-3活性的影響。在細(xì)胞水平的研究先對燒傷血清的濃度和藥物濃度以及處理時間進(jìn)行了摸索，根據(jù)細(xì)胞存活率確定最佳濃度和處理時間。分別用燒傷血清和（或）中藥對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，用FCM術(shù)檢測干預(yù)后細(xì)胞凋亡率的變化，用Caspase-3分光光度法檢測干預(yù)后細(xì)胞Caspase-3活性的變化，用Western blot的方法檢測在燒傷血清和藥物的共同作用下Hsp70的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:燒

4、傷后SD大鼠小腸粘膜細(xì)胞的凋亡率明顯增加。1ml/100g和1.5ml/100g治療組的凋亡率比燒傷組低。燒傷后SD大鼠小腸粘膜組織中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均增加，Caspase-3在蛋白水平的表達(dá)增加。1.5ml/100g治療組與燒傷組相比，Hsp70和Caspase-3在蛋白水平的表達(dá)均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，p-Akt蛋白表達(dá)隨Hsp70蛋白表達(dá)的增加而增加，兩者呈正相關(guān)。而Caspase-3

5、的相對活性和細(xì)胞凋亡率降低。MTT的結(jié)果顯示，燒傷血清和清火敗毒飲對IEC-18細(xì)胞存活率的影響均存在濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)。在燒傷血清和清火敗毒飲共同作用下，與燒傷血清組相比，凋亡相關(guān)因子Caspase-3蛋白相對活性降低，凋亡率也降低。Western blot相對定量結(jié)果顯示，治療組與燒傷血清組相比，Hsp70的表達(dá)增加。
　　結(jié)論:燒傷后腸粘膜中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均增加，發(fā)揮應(yīng)激保護(hù)作用。清火敗毒飲可能通過