基于分子標(biāo)記的8種腫腿蜂（膜翅目：腫腿蜂科）分類和花絨寄甲生物型（鞘翅目：寄甲科）研究.pdf

1、花絨寄甲Dastarcus helophoroides（Fairmaire）(Coleoptera: Bothrideridae)是目前我國控制天牛類蛀干害蟲最主要的天敵昆蟲，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于松褐天牛、光肩星天牛、云斑白條天牛、銹色粒肩天牛和栗山天牛等個體較大的天牛的生物防治，花絨寄甲初孵幼蟲一般情況下只寄生3齡以上的天牛中老齡幼蟲和蛹;而硬皮腫腿蜂Sclerodermus spp.(Hymenoptera: Bethylidae)寄生1

2、-3齡的天牛低齡幼蟲，以及吉丁類蛀干害蟲，寄生率高，防治效果好。但是硬皮腫腿蜂屬用于生物防治的多個種在外部形態(tài)上很相似，準(zhǔn)確鑒定其種類較難，而且在調(diào)查我國天牛和其他蛀干害蟲時還發(fā)現(xiàn)了幾種新的硬皮腫腿蜂種類，由于本屬腫腿蜂形態(tài)相似，它們是否為新種？再者，寄生不同天牛種的花絨寄甲經(jīng)鑒定雖為同一種，但卻表現(xiàn)出對其自身寄主的嗜好性，而對其他寄主趨性很弱，其是否已分化為不同的寄主生物型(Biotype)。對這些天敵的準(zhǔn)確鑒定是生物防治成敗的關(guān)鍵，

3、為了解決利用這兩類重要天牛天敵的分類問題，本文利用分子生物學(xué)技術(shù)，研究了硬皮腫腿蜂屬目前所發(fā)現(xiàn)的8個種的分類地位，并研究了寄生不同天牛種的花絨寄甲，以明確其是否分化為不同的寄主生物型。論文研究結(jié)果如下:
　　1.對腫腿蜂類天敵昆蟲，首次采用分子生物學(xué)技術(shù)，利用兩種方法SDS法和試劑盒法對本研究室所采集、發(fā)現(xiàn)的8種腫腿蜂假定種的單頭個體進(jìn)行基因組DNA提取。通過對比瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，以試劑盒法提取的單頭腫腿蜂基因組DNA雖價格

4、較貴，但提取總量大、成功提取率高、單位毫升濃度高。通過對8種腫腿蜂的COⅠ基因和28S核糖體基因部分序列結(jié)果分析松褐天牛腫腿蜂(Sclerodermus sp.(No.5))很有可能是一個新種，并向NCBI提交所有序列結(jié)果。擴(kuò)增出的136條594bp的COⅠ基因片段松褐天牛腫腿蜂(Sclerodermus sp.(No.5))與其它7種腫腿蜂相比，序列相似性最大僅為85.69％，與管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂和白蠟吉丁腫腿蜂的遺傳距離分別為

5、0.165、0.165、0.161。594bp的COⅠ基因片段編碼的198個氨基酸，其中管氏腫腿蜂（Sclerodermus guani）、川硬皮腫腿蜂（Sclerodermus sichuanensis）、白蠟吉丁腫腿蜂（Sclerodermus pupariae）、蘋小吉丁腫腿蜂(Sclerodermus sp.(No.1))日本松脊吉丁腫腿蜂(Sclerodermus sp.(No.2))、落葉松吉丁腫腿蜂(Sclerodermu

6、s sp.(No.3))和沙蒿吉丁腫腿蜂(Sclerodermus sp.(No.4))基因翻譯出的氨基酸序列完全一致，只有松褐天牛腫腿蜂有2個氨基酸差異，經(jīng)過NJ樹分析，松褐天牛腫腿蜂15個個體以100％的支持率單獨成為與所有群體不同的單獨一個分支。擴(kuò)增出的536bp的28S核糖體基因序列結(jié)果顯示，只有松褐天牛腫腿蜂與其它7種基因序列存在差異，其它7種腫腿蜂之間的序列相似性均為100％，而與松褐天牛腫腿蜂的序列相似性為99.18％。<

7、br>　　2.測出8種腫腿蜂的核糖體間隔區(qū)ITS1-5.8S-ITS2序列全長2060bp。通過對ITS序列分析，根據(jù)ITS1序列1319-1333bp位置處“CTTCT”的個數(shù)，將管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、白蠟吉丁腫腿蜂、沙蒿吉丁腫腿蜂、蘋小吉丁腫腿蜂、松脊吉丁腫腿蜂、落葉松吉丁腫腿蜂，這7種腫腿蜂分成兩類，其中，管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、白蠟吉丁腫腿蜂、沙蒿吉丁腫腿蜂為一類，有3個“CTTCT”單元，新發(fā)現(xiàn)的蘋小吉丁腫腿蜂、松脊吉丁

8、腫腿蜂、落葉松吉丁腫腿蜂為另一類有兩個“CTTCT”單元，所以，ITS序列能夠?qū)⑻O小吉丁腫腿蜂、松脊吉丁腫腿蜂和落葉松吉丁腫腿蜂從已知種管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂和白蠟吉丁腫腿蜂中區(qū)分出來，也為這些新發(fā)現(xiàn)的腫腿蜂個體成為新物種提供理論依據(jù)。
　　3.測出了8種腫腿蜂線粒體基因cytb，12S和16S，并提交到NCBI。分析線粒體基因的三個基因片段，并結(jié)合線粒體基因序列數(shù)據(jù)和兩種方法的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法NJ和最大似然法ML)。所得的結(jié)

9、果表明落葉松吉丁腫腿蜂的所有個體聚在一起形成一個單獨的姐妹群，并且在所測的三個基因中落葉松吉丁腫腿蜂都有很高的自檢支持率(90％以上)。同時cytb和12S基因也提供了有力的證明:松脊吉丁腫腿蜂的所有個體聚集為一個單獨的類群（自檢支持率在90％以上）。這種多個基因綜合比較分析的方法，為腫腿蜂科硬皮腫腿蜂屬的個體種類鑒定及線粒體基因的進(jìn)化提供理論依據(jù)。
　　4.對蘋小吉丁腫腿蜂、管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、白蠟吉丁腫腿蜂、落葉松腫腿蜂

10、和松脊吉丁腫腿蜂這些近緣種的mtDNA COⅡ-COⅢ基因區(qū)域進(jìn)行了序列測定與分析。結(jié)果顯示所測定的1.7kb的片段中，含有COⅡ基因部分序列，完整的tRNA-Asp基因、tRNA-Lys基因、ATPase6基因和ATPase8基因以及部分COⅢ基因。對基因序列整體分析結(jié)果表明，管氏腫腿蜂與川硬皮腫腿蜂的序列相似性最高，為100％，白蠟吉丁腫腿蜂與松脊吉丁腫腿蜂Sclerodermus sp.(No.2)的序列相似性最低為96.88％。

11、1700bp的序列中包含68個變異位點，平均遺傳距離為0.011。白蠟吉丁腫腿蜂與其它5個種（管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、落葉松吉丁腫腿蜂、松脊吉丁腫腿蜂、蘋小吉丁腫腿蜂）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，形成一個單系群。另外一個大群又分為4個亞群，而Sclerodermus sp.(No.1)的所有個體與其它種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，形成一個單獨的亞群。本研究首次獲得我國常用于生物防治的6種腫腿蜂的mtDNA COⅡ-COⅢ序列，對比分析不同基因序列分析結(jié)果可知，m

12、tDNA ATPase6基因最適合區(qū)分6種不同腫腿蜂，可以作為腫腿蜂近緣種分類鑒定的特征基因。
　　5.利用線粒體COⅠ與ND5基因片段研究了我國花絨寄甲6種不同生物型間的遺傳分化。結(jié)果表明:130條556bp的mtDNA-COⅠ基因片段中共檢測到單倍型16種，多態(tài)位點21個，均為簡約信息位點，分子變異分析(ANOVA)結(jié)果顯示Fst值為0.24358，群體內(nèi)個體間存在明顯地遺傳分化。最大相似法(ML)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，聚類結(jié)

13、果與基于不同生物型劃分的6種不同生物型不符;對于130條665bp的mtDNA-ND5基因片段中共檢測到17種單倍型，多態(tài)位點23個，其中簡約信息位點20個，單一多態(tài)位點3個，分子變異分析(ANOVA)結(jié)果顯示，F(xiàn)st值為0.11861，群體內(nèi)個體間存在明顯地遺傳分化。最大相似法(ML)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，聚類結(jié)果與基于不同生物型劃分的6種不同生物型也不相符。
　　6.通過測定多個線粒體基因序列片段(cytb，ND1，12S)研

14、究了我國花絨寄甲6種不同生物型間的遺傳分化，結(jié)果表明:130條393bp的cytb基因片段中共檢測到單倍型11種，多態(tài)位點17個，簡約信息位點15個，分子變異分析(ANOVA)結(jié)果顯示Fst值為0.19217，群體內(nèi)個體間存在明顯地遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，聚類結(jié)果與基于不同生物型劃分的6種不同生物型不符;對于130條681bp的mtDNA-ND1基因片段中共檢測到17種單倍型，多態(tài)位點23個，其中簡約信息位點20個，分子變異分析

15、(AN OVA)結(jié)果顯示Fst值為0.14549，群體內(nèi)個體間存在明顯地遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，聚類結(jié)果與基于不同生物型劃分的6種不同生物型也不相符。而擴(kuò)增出的6種不同生物型的花絨寄甲531bp的12S基因序列完全一致。本結(jié)論與上述結(jié)果5中相似。并沒有將6種不同生物型區(qū)分出來，而是發(fā)現(xiàn)松褐天?；ńq寄甲與云斑白條天?；ńq寄甲在種群個體間不存在共享單倍型，說明在遺傳上為兩個獨立的分支，這兩個生物型群體間的基因交流受到限制，遺傳距離最

16、遠(yuǎn)。因此，根據(jù)本研究結(jié)果分析，按照不同天牛危害樹種差異，最早存在2種生物型的花絨寄甲，即寄主為危害針葉樹種的松褐天牛生物型和寄主為危害闊葉樹種的云斑白條天牛生物型。
　　本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，對我國生物防治林業(yè)重大蛀干害蟲的天牛和吉丁甲的主要天敵——硬皮腫腿蜂和花絨寄甲種類及生物型從基因角度進(jìn)行了分類研究。利用核糖體ITS序列能將已經(jīng)命名的腫腿蜂和未被命名的腫腿蜂區(qū)分開;利用COⅠ和28S核糖體基因區(qū)分出松褐天牛腫腿蜂為一新種

17、;通過cytb，12S，16S核苷酸序列與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析區(qū)分出松脊吉丁腫腿蜂和落葉松吉丁腫腿蜂;利用COⅡ-COⅢ區(qū)分出蘋小吉丁腫腿蜂;利用COⅠ基因區(qū)分哈氏腫腿蜂(Sclerodermus harmandi(Buysson))和管氏腫腿蜂為兩個不同的物種。在8個已發(fā)現(xiàn)的腫腿蜂基因研究中，表明管氏腫腿蜂與川硬皮腫腿蜂的序列相似性最高，為100％;白蠟吉丁腫腿蜂與松脊吉丁腫腿蜂的序列相似性最低為96.88％;白蠟吉丁腫腿蜂與其它5個種（管

18、氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、落葉松吉丁腫腿蜂、松脊吉丁腫腿蜂、蘋小吉丁腫腿蜂）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，形成一個單系群。另外一個大群又分為4個亞群，而松褐天牛腫腿蜂的所有個體與其它種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，形成一個單獨的亞群。研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA ATPase6基因最適合區(qū)分6種不同腫腿蜂，可以作為腫腿蜂近緣種分類鑒定的有效基因。利用線粒體COⅠ與ND5基因片段和線粒體基因序列片段（cytb，ND1，12S）研究了我國花絨寄甲6種不同生物型間的遺傳分化，初步表明