內(nèi)共生菌Cardinium在中國葉螨地理種群中的分布和對葉螨的生殖調(diào)控作用.pdf

1、Cardinium是近年來在節(jié)肢動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種次生共生菌，已經(jīng)報(bào)道Cardinium具有調(diào)控寄主生殖的功能，它能夠引起雌性化，誘導(dǎo)產(chǎn)雌孤雌生殖，誘導(dǎo)胞質(zhì)不融和等。單倍二倍體種群寄主和Cardinium間相互作用時，不親和的雜交組合會導(dǎo)致受精卵部分至完全單倍體化；而對于產(chǎn)雄孤雌生殖的單倍二倍體，胚胎中父本基因組丟失或被消除后，該胚胎仍可以發(fā)育成為單倍體的雄蟲。因此，在不親和的組合中，受精卵或者發(fā)育成單倍體雄蟲或者死亡，從而逐漸減弱后代

2、的繁殖能力。朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus(Boisdlaval)和二斑葉螨T. urticae Koch是農(nóng)林生產(chǎn)中十分重要的害螨，前者危害蔬菜、棉花等多種農(nóng)作物，后者危害果樹林木、溫室栽培植物和花卉等，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成大量損失。它們擴(kuò)散迅速、世代周期短、發(fā)育進(jìn)度快、繁殖能力強(qiáng)，尤其朱砂葉螨在中國的分布范圍十分廣泛，發(fā)生甚為嚴(yán)重。不合理的化學(xué)防治使其抗性在不斷提高，所以尋求更有效的防治方法非常重要。節(jié)肢動物中的

3、共生菌擾亂寄主生殖的發(fā)現(xiàn)，不僅促進(jìn)了進(jìn)化方面的研究，同時也為葉螨的生物防治提出了新的思路。 本文利用分子生物學(xué)方法，通過PCR擴(kuò)增葉螨體內(nèi)感染的Cardinium的16S rDNA基因序列片段，分別對采自中國不同地區(qū)的朱砂葉螨與二斑葉螨的感染情況作了檢測，并對受感染種群中Cardinium的16S rDNA基因進(jìn)行序列測定，根據(jù)GenBank上登錄的一些相似度較高的節(jié)肢動物內(nèi)共生菌建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定我國葉螨感染的Cardini

4、um的進(jìn)化位置，同時分析了我國受感染地理種群間Cardinium的親緣關(guān)系，揭示了Cardinium在各地理種群間水平傳播的可能性，這有助于我們了解Cardinium的分類地位和在寄主中的分布特點(diǎn)；最后選取兩個感染率較高的代表種群，培養(yǎng)不同感染類型的品系并從中挑取雌雄蟲單獨(dú)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)我國葉螨感染的Cardinium品系能夠誘導(dǎo)寄主的胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，初步了解了其在生殖調(diào)控方面的作用。 一、試驗(yàn)材料的采集和飼養(yǎng) 在全

5、國范圍內(nèi)選擇較有代表性的地區(qū)分別對朱砂葉螨和二斑葉螨進(jìn)行采樣，共采集了27個朱砂葉螨地理種群和13個二斑葉螨地理種群。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用隔水法在菜豆(Phaseolus vulgaris L．)葉片上進(jìn)行恒溫恒濕隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為25±1℃，L 16：共生菌Cardinium在中國葉螨地理種群中的分布和對葉螨生殖調(diào)控作用的研究D 8，相對濕度60％。 二、 PcR擴(kuò)增Cardinium的16S rDNA基因序列片段，并分析比較我國

6、葉螨各地理種群中Cardinfum的感染情況 根據(jù)Wleeks等(2003)設(shè)計(jì)的一對特異性引物，從每個地理種群中隨機(jī)挑取40頭雌成螨分別提取總DNA，使用PCR擴(kuò)增Cardinium的16S rDNA基因片段，檢測了我國朱砂葉螨27個地理種群和二斑葉螨13個地理種群的感染情況，最終從朱砂葉螨的6個地理種群中擴(kuò)增出了長度約為450 bp的16S rDNA基因片段，而二斑葉螨所有地理種群中都沒有擴(kuò)增出目的基因片段。Cardiniu

7、m在中國朱砂葉螨種群間的感染率只有22.2％(6/27)，相對于Wolbachia明顯要低很多，說明Cardinium對寄主和環(huán)境條件的要求可能更高。感染Cardinium的朱砂葉螨種群在地理位置上均位于北緯30至36度之間，且包含于2個溫度帶中，即北亞熱帶和暖溫帶，說明這兩個氣候帶的氣候條件可能更適合Cardinium的生存和傳播。Cardinium在6個種群內(nèi)的感染率也各不相同，表現(xiàn)出不均勻的分布，但隨著各種群在地理上的分布位置似乎

8、有從南至北逐漸升高的趨勢，可能是由一些生態(tài)和地理因素所造成，如寄主條件、氣候條件和地理隔離等。 三、設(shè)計(jì)一段特異性引物擴(kuò)增Cardinium的16S rDNA基因并測定序列，對各地理種群之間的序列進(jìn)行比較 使用能擴(kuò)增所有真細(xì)菌16S rEINA全長的通用引物27 F和1513 R時，會擴(kuò)增出葉螨體內(nèi)可能同時存在的Wolbachia的16s rDNA。為了排除其干擾，我們設(shè)計(jì)了一對特異性引物來單獨(dú)擴(kuò)增Cardinium共生

9、菌的16s rDNA基因，測定了我國朱砂葉螨六個受感染地理種群的Cardinium的接近全長的16s rDNA基因序列片段。每個地理種群隨機(jī)抽取3～5個樣本進(jìn)行序列測定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。測得的序列長度在1338 bp左右，將測得的序列輸入GenBank(網(wǎng)站上并利用BLAST進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)它們和葉螨科的紅色型二斑葉螨Tetranychus uricae(red form)，紅葉螨Tetranychus pueraricol

10、a以及桑始葉螨Eotetranychus suginamensis的內(nèi)共生菌相似度高達(dá)99 ％，和冬青小爪螨Oligomychus ilicis的內(nèi)共生菌相似度達(dá)98％。利用GenDoc軟件，對測定的序列進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn)，安徽安慶和甘肅蘭州種群的序列完全一致，其他種群相比之下僅有少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生了堿基的變異，差異不大，這有可能說明這些種群感染的是同一個品系的Cardinium。 四、基于細(xì)菌的16S rDNA基因序列，對我國葉螨

11、感染的和國外報(bào)道的 Cardinium進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 為確定我國朱砂葉螨體內(nèi)的共生菌在Bacteroidetes菌門中的進(jìn)化位置，我們將測得的序列登錄到NCBI網(wǎng)站，并利用“BLAST”工具對測定的序列進(jìn)行分析、DNA序列檢索；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯；用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(alignment)；比對結(jié)果輸入MEGA2.1軟件，采用距離法計(jì)算各樣品間的遺傳距離，并基于Kimura-2Parameter

12、模型，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展1000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。 從系統(tǒng)發(fā)育樹中我們發(fā)現(xiàn)：我國朱砂葉螨感染的Cardinium和國外報(bào)道的屬于葉螨科的內(nèi)共生菌的序列形成了一個單獨(dú)的分支，置信度達(dá)到99％，而和細(xì)須螨科短須螨屬的Brevipalpus phoenicis，B．californicus和B．lewisi體內(nèi)的Cardinium親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而它們與Ixodes和E

13、ncarsia屬寄生蜂感染的共生茵親緣關(guān)系更近。同時，我國朱砂葉螨6個地理種群感染的內(nèi)共生菌之間的親緣關(guān)系極為相近。 五、 以兩個感染的地理種群為代表，篩選100％單獨(dú)感染和處理后完全不感染的品系，進(jìn)行不同品系間的種內(nèi)雜交實(shí)驗(yàn)，確定Cardinium對葉螨的生殖調(diào)控作用 為了了解Cardinium對我國朱砂葉螨的生殖調(diào)控作用，我們從檢測到感染Cardinium的種群中選取山西運(yùn)城和甘肅蘭州兩個感染率較高的種群作為代表，

14、對Cardinium在有關(guān)寄主生殖調(diào)控方面的作用進(jìn)行研究。通過人工培養(yǎng)100％感染Cardinium的種群和100％不感染的種群，并從中挑取不同感染類型的雌雄蟲單獨(dú)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗生素處理后不感染的雌蟲和受感染雄蟲的交配表現(xiàn)出了單向的胞質(zhì)不融和，而且兩個種群表現(xiàn)出了兩種CI類型：在山西種群不親和的組合中，CI表現(xiàn)為卵孵化率顯著降低，多數(shù)雌蟲都產(chǎn)生出F<,1>雌蟲后代，但是F<,1>代雌蟲數(shù)量相對于其它三種組合明顯減少；而在甘肅

15、種群不親和的組合中則表現(xiàn)為卵全部孵化且幼蟲100％存活，但全部為雄蟲后代。兩個種群中Cardinium的親緣關(guān)系非常相近，而它們卻能夠在不同的地理種群中表現(xiàn)出不同的CI表型，可能說明親緣關(guān)系非常接近的品系也可以產(chǎn)生不同的表型。 綜上所述，本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，從分子水平上調(diào)查了Cardinium在中國葉螨地理種群中的感染情況，并與Wolbachia的分布進(jìn)行了比較，確定了我國葉螨體內(nèi)Cardinium的進(jìn)化位置，最后，通過不