環(huán)氧化酶-2（COX-2）和血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）在乳腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌重要的轉(zhuǎn)移途徑，也是影響患者預(yù)后的主要因素。目前為止，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制并不清楚。淋巴管是腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，近年來研究表明，血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)能夠明顯促進(jìn)腫瘤組織淋巴管的生成，國外有研究表明腫瘤組織VEGF-C表達(dá)和腫瘤患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近在肺癌細(xì)胞系中研究顯示：環(huán)氧化酶-2(COX-2)可以通過其產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)來上調(diào)VEG

2、F-C的表達(dá)，可能參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。COX-2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)前列腺素合成的限速酶，只有在炎癥或腫瘤等情況下，才會被絲裂原，細(xì)胞因子，生長因子或激素等誘導(dǎo)產(chǎn)生。COX-2在多種腫瘤中高表達(dá)，在乳腺癌中，國內(nèi)外研究證實(shí)COX-2與乳腺癌的分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病人的預(yù)后密切相關(guān)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。因此，在乳腺癌中，研究COX-2和VEGF-C之間的關(guān)系對明確乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究旨在在組織和細(xì)胞兩個水平，試

3、圖探討COX-2和VEGF-C在乳腺癌的表達(dá)以及與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。在乳腺癌組織芯片中，采用免疫組化SP法進(jìn)行COX-2和VEGF-C表達(dá)的檢測，分析它們之間的關(guān)系以及和患者預(yù)后的關(guān)系；在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，轉(zhuǎn)染pNLR-COX-2質(zhì)粒，觀察COX-2和VEGF-C蛋白的表達(dá)變化以及二者的關(guān)系，并用COX-2抑制劑塞來昔布作為處理因素，觀察對轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞中COX-2和VEGF-C表達(dá)的影響。 材料與方

4、法： 1、病例和樣本 組織芯片中的117例乳腺癌組織石蠟標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受乳腺癌改良根治術(shù)或者保乳術(shù)的病人，術(shù)前均未經(jīng)過放化療并且有完整的隨訪資料，病人的平均年齡為51.4歲，病理類型為浸潤性導(dǎo)管癌的為88例，其他類型的為29例； I Ⅱ期患者為80例，Ⅲ期患者37例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，隨訪日期從手術(shù)日期開始，到疾病復(fù)發(fā)或隨訪截止日期為止，隨訪截止日期為2008年2月1日，隨訪日期為4-70個月。

5、 2、試劑 兔抗人COX-2抗體購自武漢博士德，羊抗人VEGF-C抗體購自R&D公司，二抗購自北京中衫金橋公司，轉(zhuǎn)染試劑Fugene6購自Roche Moecular Biochemicals，塞來昔布購自Pharmacia公司，IPTG購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，pNLR-COX-2質(zhì)粒由臺灣大學(xué)Min-Liang Kuo教授饋贈，ECL試劑盒購自PIERCE公司。 3、免疫組化 乳腺癌芯片由上

6、海芯超生物科技有限公司制作。采用免疫組化SP法檢測COX-2和VEGF-C的表達(dá)，按照SP檢測試劑盒說明書所示步驟進(jìn)行。 4、細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞MCF-7來自天津血液研究所，常規(guī)培養(yǎng)傳代。在六孔板中，每孔種2.5×105個細(xì)胞，參照Fugene6的說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染pNLR-COX-2質(zhì)粒。 5、Western blot 分別在瞬時轉(zhuǎn)染pNLR-COX-2質(zhì)粒后24小時及塞來昔布處理24小時收

7、集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解，蛋白抽提上樣，以10％的SDS-PAGE膠分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別用COX-2和VEGF-C的一抗和相應(yīng)二抗處理后，用ECL法進(jìn)行顯像。 6、結(jié)果判定 COX-2的免疫組化以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色，以陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為陰性，>10％為陽性，VEGF-C的免疫組化需要對所有的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評定：一，癌組織不顯色為陰性；+，局部顯色占所有癌組織面積<5％；++，局部顯色占所有癌組織面積5

8、-20％；+++，廣泛顯色占所有癌組織面積>20％?！?+”和“+++”定義為VEGF-C高表達(dá)，“-，+”定義為VEGF-C低表達(dá)。 7、統(tǒng)計分析方法 用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，進(jìn)行X2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier法計算，無病生存期差別的比較用Log-Rank時序檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、在乳腺癌組織中COX-2和VEGF-

9、C的表達(dá)以及兩者與患者臨床病理特征的關(guān)系：117例乳腺癌組織中COX-2、VEGF-C均呈高表達(dá)，分別為55.8％、58.1％，且二者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.356，P=0.000)。COX-2表達(dá)與臨床分期(r=0.201，P=0.029)、ER(r=0.224，P=0.015)、Her-2(r=0.254，P=0.006)、是否復(fù)發(fā) (r=0.312，P=0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.430，P=0.000)呈正相關(guān)。VEGF-C

10、表達(dá)與臨床分期(r=0.317，P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.202，P=0.029)、是否復(fù)發(fā)(r=0.205，P=0.027)呈正相關(guān)。 2、COX-2和VEGF-C與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系：COX-2陽性表達(dá)的患者無病生存期明顯縮短(1og-rank檢驗(yàn)，P=0.004)，VEGF-C高表達(dá)的患者無病生存期也明顯縮短(log-rank檢驗(yàn)，P=0.016)，兩者均高表達(dá)的患者和任何一個為高表達(dá)的患者，均比兩者都低表達(dá)

11、的患者的無病生存期縮短(log-rank檢驗(yàn)，P值分別為0.002，0.022)。 3、在乳腺癌細(xì)胞中，COX-2和VEGF-C的關(guān)系：Oh，24h可以觀察到轉(zhuǎn)染p-NLR-COX-2質(zhì)粒后，MCF-7細(xì)胞中COX-2蛋白的表達(dá)呈時間依賴性的上調(diào)，同時VEGF-C蛋白的表達(dá)也隨之上調(diào)。 4、在乳腺癌細(xì)胞中，塞來昔布對VEGF-C表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)染p-NLR-COX-2質(zhì)粒24h后，再經(jīng)終濃度為20微摩爾的塞來昔布的處理，M

12、CF-7細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)量下降，但COX-2的蛋白量沒有下降。 結(jié)論： 1、COX-2與VEGF-C在乳腺癌組織中高表達(dá)，兩者呈正相關(guān)，均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。 2、兩者的聯(lián)合檢測對乳腺癌患者的預(yù)后判斷更有臨床意義，兩者均高表達(dá)的患者的無病生存期明顯縮短。 3、在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，COX-2表達(dá)促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)上調(diào)。低劑量的塞來昔布抑制VEGF-C的表達(dá)，但可能不是通