PI3K-Akt信號介導缺血預適應在心肌梗死豬中抗心律失常及心功能修復作用.pdf

1、研究背景及目的：
　　急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)已成為心血管疾病中死亡率不斷增加的重要原因。心肌梗死后的惡性心律失常及心力衰竭是心肌梗死病人死亡的常見原因。心肌缺血預適應(Ischemic preconditioning，IP)是心肌在經(jīng)過反復短暫的缺血再灌注后能預防或減弱隨后長期有害的缺血再灌注損傷。研究表明缺血預適應可以抑制心室重構，減低心律失常的發(fā)生，減小心肌梗死面積，但至

2、今機理尚未完全明確。有報道IP的心肌梗死后心肌保護作用與相關的血管生長因子的表達增強有關，如血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF），缺血預適應的保護作用也取決于縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)通道的形成，縫隙連接蛋白43缺乏降低了心肌對缺血再灌注損傷的耐受力，減弱

3、了心肌梗死后缺血預適應減小心梗面積的保護作用。然而，連接蛋白43介導的保護作用與缺血預適應誘導的抗炎、抗心律失常作用與血管生成之間的確切潛在內(nèi)在關系還有待建立。既往有研究表明，缺血預適應可以觸發(fā)機體的保護機制，如使腺苷、緩激肽、內(nèi)皮素等增加，通過相應受體激活“再灌注損傷補救激酶途徑”(Reperfusion Injury Salvage Kinase，RISK)通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl-ino

4、sitol-3-kinase/protein kinaseB，PI3K/Akt)通路，導致效應器的基因轉(zhuǎn)錄和表達增加，從而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用。我們的前期實驗表明缺氧微環(huán)境后促進血管新生，側(cè)枝循環(huán)形成這些作用與PI3K/Akt通路有關。盡管PI3K途徑在缺血預適應中心臟保護作用至關重要，但PI3K/Akt信號通路在梗死心肌經(jīng)過缺血預處理之后的抗心律失常作用的機理尚不十分清楚。
　　我們對磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）

5、在缺血預適應中對連接蛋白43和促血管生成因子的影響進行探討研究，特別是缺血預適應保護缺血誘導的心律失常，改善心臟功能及抑制心肌重塑的作用。在此，我們研究了不同的缺血模型的心臟保護作用與室性心律失常的發(fā)生及對心臟性猝死的影響，通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來確定是否連接蛋白43和血管生成因子參與這些影響因素，從而探討缺血預適應在抗惡性室性心律失常及改善心功能方面的可能機制，為心肌梗死后心律失常及心力衰竭的預防與治療提供新的思路。

6、　　研究方法：
　　實驗分組方法:在誘導心肌梗死(MI)模型前將研究中使用的90只實驗小豬，隨機選擇10只正常實驗小豬進行開胸手術和假結(jié)扎LAD冠狀動脈，成為對照組。其他的80只實驗小豬被隨機分為接受局部肌肉注射磷酸鹽緩沖鹽水組(PBS)或局部注射PI3K抑制劑LY294002組，其中的20只實驗小豬被隨機分配到接受IP或沒有IP組。即將實驗動物隨機分為五組:CON(對照)組(N=10)，LI（前降支結(jié)扎）組(N=20)，IPLI

7、（缺血預適應+前降支結(jié)扎）組(N=20)，LYLI（注射LY294002+前降支結(jié)扎）組(N=20)，LYIPLI（注射LY294002+缺血預適應+前降支結(jié)扎）組(N=20)。
　　研究方法:在實驗開始前，將實驗小豬行超聲心動圖檢查，測LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD值，在誘導心肌梗死(MI)模型前，將研究中使用的90只實驗小豬，隨機選擇10只正常實驗小豬進行開胸

8、手術和假結(jié)扎LAD冠狀動脈，成為對照組。其他的80只實驗小豬被隨機分為接受局部肌肉注射磷酸鹽緩沖鹽水組(PBS)或局部注射PI3K抑制劑LY294002組，其中的20只實驗小豬被隨機分配到接受IP或沒有IP組。接下來，所有的動物進行左前降支結(jié)扎冠狀動脈(LAD)誘導心肌梗死模型，術中及術后記錄小豬發(fā)生心律失常情況，包括LAD結(jié)扎誘發(fā)首次惡性室性心律失常的時間間隔和12小時內(nèi)惡性室性心律失常累計發(fā)作時間和次數(shù)。術后60分鐘，予行心電圖(E

9、CG)，超聲心動圖(UCG)，冠狀動脈造影(CAG)證實血管閉塞。并隨訪7天，經(jīng)心超檢查測得LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD值，通過TIMI評分判定各組側(cè)枝循環(huán)情況。然后處死小豬，取出心肌。通過H&E染色法(H&E staining)，氯化三苯基四唑染色法(TTC染色)和馬森三色染色法(Masson's trichrome stain)，探討IP對心肌梗死后心肌組織重構，

10、心肌炎癥，梗死面積大小和膠原蛋白含量的影響。通過實時定量RT-PCR檢測各組心肌梗死后7天Akt和縫隙連接蛋白43的mRNA水平。通過免疫印跡電泳顯示各組Akt蛋白水平，磷酸化Akt Ser473表達水平，磷酸化Akt Thr308表達水平和連接蛋白43的水平，計算磷酸化Akt Thr308和磷酸化AktSer473與總Akt的各自比值。通過免疫組化觀察在梗死區(qū)局部表達Akt和縫隙連接蛋白43的情況。通過實時定量RT-PCR，定量分析A

11、ng-1、bFGF和VEGF的mRNA表達水平。蛋白免疫印跡檢測各組結(jié)扎LAD后7天左心室梗死周圍區(qū)域內(nèi)的Ang-1、bFGF和VEGF蛋白的表達水平。通過免疫組織化學染色顯示心肌梗死后7天各組VEGF、Ang-1、bFGF局部表達情況，應用血管因子VIII抗體染色分析心梗后各組梗死周邊血管密度。
　　研究結(jié)果：
　　1.在心肌梗死后7天，缺血預適應可以顯著降低動物死亡率和惡性室性心律失常的發(fā)生。延長心梗后首次惡性室性心律失

12、常發(fā)作間隔，縮短惡性室性心律失常累計發(fā)作時間。應用PI3K抑制劑LY294002則取消這些作用。
　　2.IP明顯提高心梗后LVEF和LVFS，改善左室重構指標(LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD)。使用PI3K抑制劑LY294002則明顯降低LVEF、LVFS值，加重左室重構。
　　3.缺血預適應可以明顯改善梗死心肌組織重構，表現(xiàn)為減少心肌的炎癥反應和減小心肌

13、梗死面積，減少膠原面積，增加梗死區(qū)域殘存心肌存活數(shù)量。使用PI3K抑制劑LY294002則使梗死心肌重構惡化，表現(xiàn)為增加炎癥反應，膠原含量及心梗面積，減少梗死區(qū)域心肌存活。
　　4.IP促進心梗后Akt表達水平增高，促進Akt磷酸化，上調(diào)心肌組織縫隙連接蛋白43表達，改善心肌重構，應用PI3K抑制劑LY294002明顯抑制Akt表達，降低Akt磷酸化及縫隙連接蛋白43表達。
　　5.IP促進梗死心肌血管生長因子Ang-1、b