靜脈石生物礦化機(jī)制的初步研究.pdf

1、脈管性疾病(Vascular anomalies)包括血管瘤(Hemangioma)和脈管畸形(Vascular malformation)二大類，可發(fā)生于全身各個部位，其中發(fā)生于頭頸部的脈管性疾病約占全身同類疾病的4096～60％，除了造成美容缺陷外，還可引起相應(yīng)功能障礙，給患者帶來極大的精神創(chuàng)傷和心理負(fù)擔(dān)。靜脈石為頭頸部靜脈畸形中較常檢出的病理性礦化灶，伴隨著疾病的發(fā)展。一般認(rèn)為，靜脈石是由于病灶內(nèi)血流動力學(xué)改變，血液中的鹽類物質(zhì)沉

2、積并形成血栓，血栓進(jìn)一步鈣化所形成。然而，此礦化機(jī)制尚屬推測，因此有必要進(jìn)一步探討靜脈石的生物礦化機(jī)制。本研究從靜脈石的角度出發(fā)，探討靜脈畸形的病理機(jī)制，目的在于深入認(rèn)識靜脈畸形的病理過程，在此基礎(chǔ)上以期預(yù)防、調(diào)整，甚至逆轉(zhuǎn)靜脈石的形成，獲得更好的治療效果。 生物礦化(Biomineralization)是指有機(jī)體調(diào)控下形成礦物質(zhì)的過程。當(dāng)機(jī)體對生物礦化調(diào)控作用失衡，無機(jī)離子在不該礦化的部位形成異位礦化或異常礦化組織，或造成礦化

3、組織礦化過度或不足稱為病理性礦化(Pathologicalmineralization)。感染是影響病理性礦化過程的一個重要因素。上世紀(jì)八十年代后期，芬蘭科學(xué)家Kajander等在進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在一種超微原核微生物，認(rèn)為此微生物可能來自細(xì)胞培養(yǎng)所需的胎牛血清。1990年Kajander正式將這種原核微生物命名為納米細(xì)菌(Nanobacteria， NB)，并申請了專利。近年這種超微結(jié)構(gòu)亦被稱為鈣化性納米顆粒(Cal

4、cifyingNanoparticles，CNP)。納米細(xì)菌廣泛存在于自然界的礦物質(zhì)中和生物體內(nèi)，是一種人畜共患的致病原，能感染人類和其它哺乳動物的任何組織和細(xì)胞，其生長過程中能在菌體周圍產(chǎn)生堅硬的礦化外殼，作為結(jié)晶核心，導(dǎo)致被感染組織或細(xì)胞發(fā)生病理性礦化。研究發(fā)現(xiàn)，納米細(xì)菌與人體內(nèi)多種組織的病理性鈣化和硬化的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 納米細(xì)菌的提出，為研究靜脈石的礦化機(jī)制提供一個新的切入點(diǎn)，因此我們設(shè)想納米細(xì)菌與靜脈石的形成相關(guān)。本研

5、究首先對靜脈石進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分分析，再試圖從靜脈石中分離、培養(yǎng)出納米細(xì)菌，以探索靜脈石的生物礦化機(jī)制。 第一部分：靜脈石的超微結(jié)構(gòu)分析 目的：明確靜脈石的超微結(jié)構(gòu)。 方法：5例靜脈石，過中心剖開，分別從內(nèi)部和外層各取一小塊，噴金處理后，掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)下觀察其超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：SEM下發(fā)現(xiàn)靜脈石由內(nèi)至外呈同心圓板層狀結(jié)構(gòu)，4例靜脈石內(nèi)

6、部和外層的超微結(jié)構(gòu)均以針狀晶體為常見，該晶體與羥基磷灰石相似；1例靜脈石內(nèi)部亦以針狀晶體為主，而外層為緊密排列的條索狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：靜脈石的形成過程為先形成礦化核心，其他物質(zhì)圍繞核心呈同心圓逐層沉積而成，其內(nèi)可能含羥基磷灰石晶體。 第二部分：靜脈石的化學(xué)成分分析 目的：明確靜脈石的化學(xué)成分組成。 方法：5例靜脈石，過中心剖開，分別從內(nèi)部和外層各取一小塊，能量色散型X一射線分析儀(Energy Disper

7、sive X-ray spectrometry， EDS)下分別定量檢測靜脈石內(nèi)部和外層的元素組成。另取一小塊研成粉末，X-射線衍射分析儀(X-ray diffraction analysis，XRD)下進(jìn)行物相分析。 結(jié)果：EDS下3例靜脈石內(nèi)部和外層含有的元素依次為氧、鈣、磷、鈉、鎂，前三者質(zhì)量含量超過98％，另外2例靜脈石內(nèi)部和外層還有較高含量的碳元素。4例靜脈石鈣磷質(zhì)量及原子比值在內(nèi)部和外層都較接近，質(zhì)量比為1.73～

8、2.35：1，原子比為1.34～1.81：1。5例靜脈石鈣磷含量平均值的質(zhì)量及原子比在內(nèi)部分別為2.15：1和1.67：1，在外層分別為1.83：l和1.41：1。XRD物相分析顯示4例靜脈石為羥基磷灰石結(jié)晶，1例靜脈石為非結(jié)晶物質(zhì)。 結(jié)論：靜脈石的形成過程為有機(jī)物呈同心圓樣逐層沉積，并由內(nèi)至外逐步礦化為無機(jī)物而成，其晶相為羥基磷灰石晶體。 第三部分：靜脈石中納米細(xì)菌的分離、培養(yǎng)與初步鑒定 目的：明確靜脈石的形成

9、是否與納米細(xì)菌相關(guān)，以探索靜脈石的生物礦化機(jī)制。 方法：靜脈石中納米細(xì)菌的分離和培養(yǎng)：14例靜脈石脫礦后研碎，重懸粉末，離心，收集上清經(jīng)O．22p,m濾器過濾至培養(yǎng)瓶，加入含10％ γ-射線滅活的胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)，在37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。納米細(xì)菌的初步鑒定：倒置相差顯微鏡觀察該菌形態(tài)及生長特性，單克隆抗體8D10和G1B8免疫細(xì)胞

10、化學(xué)染色和間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測納米細(xì)菌抗原，透射電鏡(Transmission electron microscope，TEM)觀察培養(yǎng)細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：78.6％(11/14)的靜脈石分離、培養(yǎng)出納米細(xì)菌樣顆粒，其形態(tài)學(xué)特征和生長特性與納米細(xì)菌相似，單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色和間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性，電鏡觀察到納米大小菌樣顆粒。 結(jié)論：從靜脈石中能分離到納米細(xì)菌，該菌可能在靜脈石的形成中起重要作