人血小板冷凍干燥保存工藝的優(yōu)化研究.pdf

1、冷凍干燥保存法以其保存時間長、穩(wěn)定性好、儲運方便以及復水后迅速恢復活性等優(yōu)點，為血小板的長期穩(wěn)定保存提供了一種理想的方法。血小板在凍干保存過程中會面臨冷凍損傷，激活損傷，干燥損傷以及復水造成的損傷，目前的血小板凍干保存技術離臨床應用還有很大的距離。本文以提高冷凍干燥復水后血小板的形態(tài)和功能恢復率為目標，對血小板凍干工藝進行了以下研究工作：
　　 ⑴研究了超聲波用于輔助海藻糖載入血小板的可行性。在37℃液相內(nèi)吞作用的基礎上，低頻超

2、聲的加入有利于海藻糖的載入。經(jīng)頻率25 kHz，強度0.4W/cm2的超聲波輻射1 h后，海藻糖的平均載入量比傳統(tǒng)方法提高了1.46倍。超聲處理后的血小板血液學分析、形態(tài)觀察及流式細胞術分析結果與新鮮血小板不存在顯著性差異。
　　 ⑵研究了退火環(huán)節(jié)對血小板凍干效果的影響。通過凍結速率(A)、退火速率(B)、退火溫度(C)及退火時間(D)四因素的三水平正交實驗及凍干復水后血小板的數(shù)值恢復率、細胞形態(tài)結構及活化率等指標的檢測表明，在

3、其他凍干參數(shù)固定的條件下，實驗的四個預凍因素對血小板的數(shù)值恢復率均有顯著作用，影響程度依次為B>C>D>A。預凍的最佳工藝如下：將血小板懸液以20℃/min的速率凍結至-40℃以下，維持2 h，再以1.5℃/min的速率對擱板升溫至-30℃后維持0.5 h。經(jīng)電子顯微鏡觀察，由最佳預凍工藝凍干的血小板超微結構完整。
　　 ⑶研究了復水溶液、預復水時間和溫度等因素對凍干血小板復水效果的影響。在四種濃度的復水溶液中，濃度為75％的血

4、漿效果最佳，其復水后的血小板恢復率達到(89±3.6)％，PDW增加率最小。對1 mL和2mL凍干樣品的預復水研究表明：預復水溫度35℃和37℃無顯著差別，1 mL樣品在37℃的飽和水蒸氣中預復水15 min、2 mL樣品預復水90 min能使得血小板的恢復率最高，此時，二者含水量基本一致。
　　 ⑷在以上冷凍干燥工藝優(yōu)化研究的基礎上，本文進一步檢測了凍干血小板的活性指標。采用工藝如下：1 mL經(jīng)海藻糖載入后的血小板懸液以20℃

5、/min的速率凍結至-60℃固化，在-40℃進行一次干燥，20℃進行二次干燥，凍干保存30天后的血小板在37℃下以飽和水蒸氣相對分壓5.9 kPa的蒸氣預復水15min，再經(jīng)75％血漿復水。復水后血小板的形態(tài)及超微結構保持完整，經(jīng)1 U/mL凝血酶刺激后，最高聚集率為新鮮血小板對照組的82.8％，在4 min內(nèi)的聚集速率達到15.75％/min，為新鮮血小板的16.9％。
　　 ⑸本文提出的超聲波強化海藻糖載入血小板的方法，為哺