水稻光氧化突變體812HS光合特性及其光氧化機(jī)制研究.pdf

1、本研究以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的秈稻兩用不育系812S中的1個農(nóng)藝性狀基本一致的葉片光氧化突變株系812HS為材料。江蘇地區(qū)6月中下旬梅雨連綿，光照較弱，該突變體葉片正常綠色，7月中旬至8月上旬，在梅雨結(jié)束后的強(qiáng)烈陽光照射下，812HS葉片出現(xiàn)非常強(qiáng)烈的光氧化傷害，尤其是倒二、倒三葉出現(xiàn)明顯的失綠現(xiàn)象，而野生型葉色則正常綠色。基因定位分析發(fā)現(xiàn)，該突變基因是位于第4染色體分子標(biāo)記M22與M102之間約55.42kb區(qū)域內(nèi)的一個新基因，暫命名

2、為LPO1(t)(Leaf photo-oxidation1)。本研究圍繞812HS葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的變化，研究葉綠體光能吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞性能，并對整個生長發(fā)育時期的生理生化進(jìn)程、尤其是光氧化發(fā)生期的蛋白質(zhì)組分和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了研究，對于闡明水稻葉片光氧化的分子遺傳機(jī)理和指導(dǎo)水稻耐強(qiáng)光育種具有重要意義。研究結(jié)果如下:
　　(1)812HS的表型隨著光照強(qiáng)度增加，812HS中的總?cè)~綠素含量逐漸減少，到8月4日，葉綠素含量明顯下降，Ch

3、l a/b值則從6月23日（光氧化尚未發(fā)生）開始到8月4日（光氧化現(xiàn)象最明顯）逐漸增大，以后逐漸減小。部分遮陰處理顯示，在弱光生長條件下，812HS和野生型的葉片均未出現(xiàn)光氧化現(xiàn)象，而對照（強(qiáng)光，氣溫同弱光條件）兩者差異明顯，證明自然條件下812HS發(fā)生葉片光氧化是由強(qiáng)光引起。對葉片葉綠素合成前體物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，可能是由UrogenⅢ至ProtoⅨ階段受阻導(dǎo)致葉綠素含量降低。利用透射電子顯微鏡觀察葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，6月23日突變體及其野生型

4、的葉綠體結(jié)構(gòu)均完整，類囊體片層堆疊整齊，基粒堆積致密、排列有序，并且有大小不等的淀粉粒（造粉體）存在。8月4日，812HS中的葉綠體已由梭形變?yōu)榍蛐危~綠體體積變大，基粒片層模糊，淀粉粒減少，出現(xiàn)嗜鋨顆粒，甚至部分葉綠體的類囊體解體，而野生型葉肉細(xì)胞中葉綠體有大量淀粉粒積累，類囊體片層仍堆疊緊密，說明812HS葉綠體結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。
　　(2)812HS的光合性能葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線分析發(fā)現(xiàn)PSⅠ和PSⅡ存在緊密相互作用的逆

5、境防御策略。強(qiáng)光主要是對812HS的放氧復(fù)合體造成傷害，從而影響光系統(tǒng)間的電子傳遞鏈。812HS主要是通過增加PSⅡ中熱耗散相關(guān)參數(shù)(ψD0、DI0/CSm和DI0/RC)來緩解光氧化對反應(yīng)中心的傷害。PSⅡ光合性能指數(shù)PIABS和FV/FM7月14日時較高，隨著強(qiáng)光照時間的延長，到8月4日開始下降。8月4日時812HS的凈光合速率明顯降低，胞間二氧化碳濃度明顯增加，光合磷酸化水平、ATP含量、Ca-ATPase和Mg-ATPase活性

6、降低。另外，隨著強(qiáng)光照時間的延長，812HS中的葉黃素循環(huán)庫逐漸增加，V逐漸減少，A和Z含量隨之增加，說明812HS在強(qiáng)光下通過葉黃素循環(huán)耗散過剩激發(fā)能來緩解對葉片的傷害，也進(jìn)一步說明8月4日時812HS的能量代謝已經(jīng)失衡。
　　(3)8月4日時812HS的RuBisCO酶活力下降，PEPCase和NADP-ME酶活性上升，推測可能是強(qiáng)光下C4光合代謝或者C4光合途徑對RuBisCO酶活性下降或提前降解的補(bǔ)償。非生物脅迫引起活性氧

7、傷害主要來自于ROS的產(chǎn)生。強(qiáng)光下，812HS葉片中O2-、H2O2、MDA含量逐漸增加。8月4日時812HS的SOD活性也增加，然而，O2-產(chǎn)生更多，傷害可能是由于O2-的產(chǎn)生速率超過了SOD清除O2-的能力的增加。另外，SOD活性隨著衰老在9月15日時顯著降低，雖然POD、CAT、APX和GR活性略微增加，仍然導(dǎo)致H2O2積累，葉綠體膜的結(jié)構(gòu)受損以及黃化失綠表型證實(shí)了這一點(diǎn)，這些結(jié)果都說明8月4日時812HS的抗氧化酶系統(tǒng)已經(jīng)失去了

8、本身的平衡。
　　(4)利用雙向電泳技術(shù)對8月4日的812HS與野生型葉片的差異蛋白進(jìn)行分析，成功鑒定了56個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中的53個，涵蓋了大范圍的生物功能與代謝通路。與野生型相比，812HS中有32蛋白點(diǎn)上調(diào)，21個蛋白點(diǎn)下調(diào)(P＜0.05，1.5-4.9倍）。這些差異蛋白按照功能可以分為9組，主要是與光合作用(30.43％)、呼吸和能量代謝(16.67％)、抗性(17.39％)、蛋白儲存或降解(13.04％)相關(guān)，剩下的一些

9、是功能未知蛋白(13.04％)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，這53個蛋白質(zhì)位于葉綠體(50％)、線粒體(5.76％)、細(xì)胞質(zhì)(11.54％)、細(xì)胞膜(7.69％)和過氧化物酶體(1.92％)，還有23.09％的具體位置未知。在強(qiáng)光照射下，光合作用相關(guān)蛋白RuBisCO大亞基和大鏈前體上調(diào)，其活化酶下調(diào)，導(dǎo)致光合作用減弱。同時，消除活性氧等有害物質(zhì)的過氧化物酶類蛋白和防御相關(guān)蛋白在812HS中也表達(dá)上調(diào)，表明這些蛋白在水稻光氧化代謝方面起重要作用

10、。
　　(5)通過差異倍數(shù)(|log2(Fold change)|＞1)和顯著水平(q_value＜0.05)挑選出轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異基因，發(fā)現(xiàn)基于野生型在812HS基因表達(dá)譜2540個差異基因中有1342個基因上調(diào)，1198個基因下調(diào)。對Cuffdiff找到的差異基因進(jìn)行KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，共有546個Unigenes參與到21條KEGG代謝通路中。其中，代謝和遺傳信息處理是兩個富集豐富的代謝通路，磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝

11、、乙醛酸和二羧酸代謝、檸檬酸循環(huán)糖酵解/糖異生、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、光合生物中的碳固定、光合作用、苯丙素生物合成、芳香化合物的降解、碳代謝、氨基酸的生物合成以及代謝途徑包含在代謝通路。核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接體以及蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工包含在遺傳信息處理類。此外，一些重要的通路也明顯富集，例如機(jī)體系、細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理。這些結(jié)果暗示，參與到這些通路的基因在光氧化條件下起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果為拓展對光氧化的進(jìn)程、功能和途徑的理解