檉柳乙烯響應(yīng)因子ThERF1基因應(yīng)答高鹽脅迫的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、乙烯響應(yīng)因子(ERF)轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是AP2/ERF家族中一個(gè)亞家族。ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠通過識(shí)別GCC-box和DRE元件來調(diào)控下游基因的表達(dá)，根據(jù)下游功能基因所參與的生理活動(dòng)來調(diào)控植物對(duì)于生物脅迫及非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。
　　本研究首先從檉柳中獲得了16個(gè)具有完整ORF的ERF基因序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究它們?cè)诟啕}、干旱和ABA脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這些基因的表達(dá)在NaCl、PEG和ABA

2、脅迫下都發(fā)生顯著的差異表達(dá)，說明這些基因均可能參與植物對(duì)逆境的應(yīng)答反應(yīng)和ABA信號(hào)途徑。
　　在以往研究中，我們已經(jīng)克隆了ThERF1，本研究對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。構(gòu)建pROKⅡ-ThERF1-GFP融合表達(dá)載體，利用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)研究ThERF1的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，ThERF1表達(dá)后定位于細(xì)胞核。
　　對(duì)轉(zhuǎn)ThERF1基因擬南芥進(jìn)行抗逆能力分析。結(jié)果表明，在干旱和鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率及生長(zhǎng)情況均弱于野生型擬

3、南芥，并且轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的ROS水平和細(xì)胞膜破壞程度要高于野生型擬南芥;在干旱、鹽和ABA脅迫下，通過對(duì)SOD活性、POD活性、MDA含量、葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率和H2O2含量生理指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)ThERF1轉(zhuǎn)基因擬南芥的SOD、POD活性及葉綠素含量均低于野生型擬南芥，而MDA、H2O2含量及相對(duì)電導(dǎo)率均高于野生型擬南芥;對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中SOD和POD基因在干旱、鹽和ABA脅迫下的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量

4、均明顯低于野生型，說明ThERF1通過抑制SOD及POD基因的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株中的SOD和POD活性減少，使得ROS積累，膜質(zhì)過氧化程度升高級(jí)細(xì)胞膜破壞，進(jìn)而轉(zhuǎn)基因植株對(duì)逆境脅迫敏感。
　　從檉柳轉(zhuǎn)錄組中克隆到了7個(gè)與ThERF1同源的檉柳ERF基因，利用酵母雙雜交技術(shù)研究ThERF1與這些ERF蛋白間的互作。結(jié)果表明，ThERF1不僅能與自身形成同源二聚體，還能與ThERF4、ThERF11和ThERF16形成異源二聚體發(fā)揮

5、功能。
　　分析ThERF1基因的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子中包含GCC-box、W-box和MBS這3個(gè)脅迫相關(guān)的順式作用元件，利用酵母單雜交技術(shù)研究ThERF1基因上游能夠識(shí)別這些元件的調(diào)控因子。結(jié)果表明，ThERF10能夠特異性識(shí)別GCC-box，ThWRKY2和ThWRKY8特異性識(shí)別W-box，ThMYB2和ThMYB9特異性識(shí)別MBS。
　　利用酵母單雜交，和構(gòu)建effector和reporter載體，利用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)