NRF-1在紅霉素預適應大鼠局灶性腦缺血中的表達變化及其機制的初步探討.pdf

1、目的：
　　 腦缺血預適應是指通過對腦一次或多次短暫的非致死性缺血損傷后,可觸發(fā)機體啟動內源性保護機制繼而對隨后的長時間缺血損傷產(chǎn)生耐受性,是機體的一種重要保護機制[1]。目前,對紅霉素這種臨床常用的大環(huán)內酯類抗生素的研究越來愈多,Ansgar M等人證實了紅霉素預適應在大鼠全腦缺血模型中通過模擬缺血缺氧誘導對腦組織的保護作用[2]。Koerner IP[3]等人發(fā)現(xiàn)了紅霉素誘導缺血耐受可以改編腦缺血組織轉錄程序并且抑制炎癥反應

2、,有研究表明紅霉素可以干擾線粒體能量代謝從而模擬缺血從而誘發(fā)適應的[4-7],本研究旨在證實NRF-1在紅霉素預適應中表達增強,與預適應的機制關系密切,并參與干擾線粒體的呼吸鏈。本實驗通過免疫組化方法探討NRF-1與紅霉素缺血預適應之間的定性關系,研究其與呼吸鏈的相關性。
　　 材料與方法：
　　 一、材料：
　　 成年雄性SPF級Wistar大鼠(280-310g)購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心;乳糖酸紅霉素購自

3、大連美羅制藥廠;免疫組化用Rabbit anti-NRF-1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG二抗(1:500),二步法免疫組化試劑盒(PV29000);DAB顯色劑。
　　 二、紅霉素預處理和實驗分組：
　　 我們將大鼠隨機分為6組(n=6),分別為:對照組;缺血組;紅霉素組;紅霉素+缺血組;紅霉素+7NI(7-nitroindazole)組;紅霉素+缺血+7NI組。對照組未予特殊處置

4、,缺血組為無預適應單純缺血,紅霉素組在缺血前12小時給109PD肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)預適應,紅霉素+7NI組為給予肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)和7NI(50mg/kg)預適應,紅霉素+缺血+7NI組為缺血前12小時給予肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)和7NI(50mg/kg)預適應。
　　 三、大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型(MCAO)的建立：
　　 大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350m

5、g/kg)麻醉,分離右側頸總動脈(commoncarotid artery,CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)頸外動脈(external carotidartery,ECA),結扎ECA遠端,在CCA遠端近分叉處剪口,插入直徑0.26mm的尼龍線使其由ICA入顱致大腦中動脈近端,阻斷大腦中動脈的血流。在缺血2小時后將尼龍線拔出形成再灌注,持續(xù)觀察24小時,取腦固定。
　　 四、腦梗死體積

6、測定(TTC染色)：
　　 將6個分別取5只大鼠斷頭取腦,缺血組再灌注24小時后斷頭取腦,取出的腦組織至于-20℃冰箱快速冰凍20分鐘,從額極開始每隔2mm冠狀切取腦組織5片,置于2％TTC中,37℃水浴避光孵育30分鐘,計算腦梗死體積百分比。參考Shrimakura的方法減少水腫對梗死體積的影響即梗死體積(％)=[LV-(RV-MV)]/RV×100％,其中MV是總梗死體積,LV,RV分別是左右半球的梗死體積。
　　

7、五、免疫組化染色：
　　 應用免疫組化SP法檢測紅霉素預適應大鼠局灶性腦缺血模型中NRF-1的表達情況。取一組先行HE染色做比照,再行免疫組化。以海馬區(qū)細胞核中出現(xiàn)棕褐色顆?；蚓咀睾稚x為陽性。對于每張切片計數(shù)其陽性百分率,無陽性細胞為(-),(+)為陽性細胞總數(shù)的≥5％,(++)為陽性細胞總數(shù)的5％-25％,(+++)為陽性細胞占總數(shù)25％-50％,(++++)為陽性細胞≥總數(shù)的50％。
　　 六、統(tǒng)計方法：

8、>　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(X±S)表示,數(shù)據(jù)進t檢驗,p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 一、腦梗死體積的比較：
　　 腦組織TTC染色后,正常組織染成紅色,梗死灶染成白色。實驗結果顯示,大腦中動脈缺血再灌注后,梗死灶位于右側額、顳、頂部皮質區(qū)以及新紋狀體外側部。紅霉素缺血組與單純缺血組相比梗死面積明顯減小,有顯著差異(p＜0.05)

9、,紅霉素+7NI+缺血組與單純缺血組相比缺血面積有所減少,但統(tǒng)計學未見顯著差異p＞0.05)。紅霉素+7NI+缺血組與紅霉素缺血組相比梗死面積增加,有顯著差異p＜0.05)。
　　 二、免疫組織化學染色：
　　 (1)nNOS染色陽性表現(xiàn)為皮質神經(jīng)元細胞漿內著黃色,在紅霉素缺血預適應組表達強烈。陽性率高[20],與單純缺血組和紅霉素組相比有顯著差異(p＞0.05),并且可以被7NI阻斷。
　　 (2)NRF-1染

10、色陽性表現(xiàn)為神經(jīng)元細胞核內有棕褐色著色,尤其在紅霉素預適應缺血腦組織表達強烈,陽性率為40.83％,在紅霉素組和缺血組分別為20.70％和24.82％。在對照組陽性率為14.03％,與紅霉素組相比表達陽性率有顯著差異(p＜0.05),與紅霉素缺血組相比(t=3.8779,p＜0.01)。
　　 結論：
　　 1、紅霉素預適應對大鼠局灶性急性腦缺血損傷具有保護作用,能明顯減少腦缺血后腦梗死體積。
　　 2、NRF-