髓細(xì)胞白血病的“二次打擊”事件研究.pdf

1、近來(lái)的分子遺傳學(xué)研究揭示包括癌基因的激活和抑癌基因的失活在內(nèi)的多次遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程是必需的。實(shí)體腫瘤癌變過(guò)程的“多次打擊學(xué)說(shuō)”在結(jié)直腸癌的發(fā)生中得到證實(shí)，大多數(shù)結(jié)直腸癌都是由良性的腺瘤發(fā)展而來(lái)，腺瘤息肉病基因(APC)與家族性的腺瘤息肉病(FAP)有關(guān)。另外，癌基因K-ras的激活和幾個(gè)抑癌基因如MCC，p53和DCC的失活在結(jié)直腸癌發(fā)生的特定階段中起重要作用。而惡性血液腫瘤以染色體易位為主要特征，只有19％的急性髓細(xì)胞

2、白血病(AML)患者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)染色體異常，那么某種染色體易位是否就能導(dǎo)致白血病的發(fā)生呢t(8；21)(q22；q22)染色體易位產(chǎn)生AML-1-ETO融合蛋白，發(fā)生于10-15％的AML中，即AML-M2。造血干細(xì)胞表達(dá)AML-1-ETO的小鼠只會(huì)發(fā)生骨髓增生性疾病(MPD)，而骨髓細(xì)胞中激活型受體酪氨酸激酶TEL-PDGFBR和AML-1-ETO共表達(dá)的小鼠才會(huì)產(chǎn)生類AML-M2表型。 隨著對(duì)致白血病相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能研究的深入

3、，逐漸形成了急性髓細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制的多次打擊模型，即急性髓細(xì)胞白血病至少是兩大類基因異常協(xié)同作用的結(jié)果，即AML發(fā)生的“二次打擊學(xué)說(shuō)”：Ⅰ類基因異常賦予造血細(xì)胞以增殖及生存優(yōu)勢(shì)，持續(xù)激活酪氨酸激酶或其下游分子；Ⅱ類基因異常累及在正常造血分化調(diào)控中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，異常造成它們功能喪失，使造血細(xì)胞分化受阻和隨后的凋亡受抑。不管異常獲得的先后如何，這兩類異常共同賦予了白血病細(xì)胞不斷增殖、生存優(yōu)勢(shì)以及分化受阻最終導(dǎo)致AML的發(fā)生。旨在闡

4、明白血病發(fā)病機(jī)制，尋找亞型特異基因組異常的“白血病基因組解剖學(xué)計(jì)劃”應(yīng)運(yùn)而生。據(jù)此，選擇Ⅰ類基因2個(gè)以及Ⅱ類基因10個(gè)作為候選基因。因?yàn)锳ML-M4、M5和慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)急性轉(zhuǎn)化患者都有特征性的染色體異常，所以，我們主要在AML-M4、M5和CML急性轉(zhuǎn)化患者中進(jìn)行突變篩查，希望能找到相關(guān)的“二次打擊”事件，發(fā)現(xiàn)新的白血病致病機(jī)制，也為臨床監(jiān)控和治療提供新的靶點(diǎn)。 2個(gè)Ⅰ類基因，NRAS和KRAS突變發(fā)生在AML-

5、M4和M5亞型，兩者之間的相關(guān)性還需要在大樣本中進(jìn)行基因分型來(lái)證實(shí)。在10個(gè)Ⅱ類基因中的五個(gè)發(fā)現(xiàn)突變或多態(tài)，主要發(fā)生在CML急性轉(zhuǎn)化患者中。有意義的是，AML-1基因突變?cè)贑ML急性轉(zhuǎn)化患者中的發(fā)生頻率為12.9％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的2.02％，在11例CML急性轉(zhuǎn)化患者中發(fā)現(xiàn)10種AML-1基因突變，其中有五種突變是新發(fā)現(xiàn)的突變。在含突變患者的慢性期標(biāo)本中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變，用MassArray在正常對(duì)照樣本中進(jìn)行基因分型結(jié)果也提示這些突

6、變?yōu)镃ML急性轉(zhuǎn)化患者所特有。而且，突變使11例CML患者都朝著粒系方向急性轉(zhuǎn)化。由此推測(cè)，AML-1突變與CML急性轉(zhuǎn)化相關(guān)，可能就是CML急變的第二次打擊事件之一。 選擇四種AML-1突變蛋白進(jìn)行功能研究。結(jié)果顯示：Runt結(jié)構(gòu)域?qū)ML-1的功能至關(guān)重要，3個(gè)發(fā)生在Runt結(jié)構(gòu)域的突變蛋白，H78Q、V91fs-ter94和R139G，轉(zhuǎn)錄激活能力均喪失，其中H78Q和V91fs-ter94對(duì)野生型蛋白有抑制作用，而R29

7、3X轉(zhuǎn)錄激活能力沒(méi)有變化。V91fs-ter94有明顯的核漿共定位，其余突變蛋白與野生型蛋白差別不大，主要呈核定位。 CML急變期與慢性期相比以分化阻滯為主要特征。為研究AML-1突變蛋白對(duì)白血病細(xì)胞增殖和分化的影響，我們構(gòu)建了pcDNA3.1空載、R139G和R293X穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞株，用ATRA和1，25α-二羥基維生素D3分別誘導(dǎo)HL60細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分化。與pcDNA3.1空載相比，R139G和R293

8、X對(duì)HL60細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用，三組間S期和G2/M期細(xì)胞所占比例沒(méi)有明顯差別。有意義的是，R139G和R293X只對(duì)細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化有抑制作用。這些結(jié)果表明，AML-1突變蛋白可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞向粒系分化，而對(duì)細(xì)胞向單核系分化幾乎沒(méi)有影響。這與我們發(fā)現(xiàn)的伴AML-1突變的CML患者都向粒系急性轉(zhuǎn)化相一致。 BCR-ABL屬于Ⅰ類基因的異常，AML-1突變是Ⅱ類基因的異常，二者聯(lián)合作用使CML患者向急性轉(zhuǎn)