家兔全卵巢移植所致缺血對卵泡早期生存狀態(tài)影響的研究.pdf

1、目的：
　　隨著醫(yī)療診斷及治療技術(shù)的提升，癌癥患者的生存率不斷提高。但仍舊日存在一個(gè)問題，放化療對卵巢造成的不可逆損害，使得年輕女性出現(xiàn)卵巢早衰(POF)及生育能力嚴(yán)重受損。其中經(jīng)過細(xì)胞毒藥物烷化劑、腹部放射治療的癌癥女性患者發(fā)生卵巢早衰后不孕的概率接近100％[1]。目前生殖能力保存方式有胚胎冷凍移植，卵母細(xì)胞冷凍移植，卵巢皮質(zhì)片冷凍移植，全卵巢冷凍移植[2]。其中全卵巢冷凍移植是目前保存生殖能力令人振奮又最具挑戰(zhàn)的技術(shù)之一。缺

2、血是導(dǎo)致長期移植過程卵泡大量丟失的首要因素[1]，使得全卵巢移植仍舊不理想。短時(shí)缺血對移植早期的卵泡生存狀態(tài)的影響研究較少。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立家兔新鮮全卵巢移植模型，探討短時(shí)缺血在移植早期對卵泡生存狀態(tài)的影響，摸索卵泡早期卵泡生存狀態(tài)的變化，從而為以后全卵巢冷凍和移植降低缺血影響提供早期干預(yù)參考及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　20只5月齡性成熟的日本大耳白兔(2.0-2.5kg)，經(jīng)麻醉后實(shí)施雙側(cè)卵巢切除術(shù)。右側(cè)卵巢做為左側(cè)

3、卵巢的新鮮對照。左側(cè)卵巢經(jīng)預(yù)冷的肝素鈉溶液(100IU/ml)灌注15min后，將左側(cè)卵巢移植至對側(cè)，左卵巢動脈與右側(cè)卵巢動脈殘端以端端吻合方式間斷吻合，左卵巢靜脈與右側(cè)卵巢靜脈殘端以端端吻合方式連續(xù)吻合，均在×20視野下進(jìn)行。整個(gè)移植過程控制在30min內(nèi)完成。卵巢皮質(zhì)的泛紅及動脈搏動良好是評判移植后血循環(huán)通暢的指標(biāo)。之后分別在移植后1天(1D，n=4)，3天(3D，n=4)，1周(1W，n=4)，2周(2W，n=4)，1月(1M，n

4、=4)取出移植卵巢，行石蠟包埋HE染色光鏡下形態(tài)學(xué)分析，免疫組化PCNA(proliferating cell nuclear antigen)及雙色熒光GLI及Patched(Hedgehogsignaling pathway)檢測卵泡增殖情況，TUNEL分析檢測卵泡凋亡情況，實(shí)時(shí)熒光PCR半定量PCNA，GLI，Patched，Bcl-2，Bax，Caspase-3基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一.組織學(xué)檢查
　　

5、各組的移植后卵巢組織均可觀察到形態(tài)正常的各級卵泡，包括原始卵泡，初級卵泡，次級卵泡等。與每只卵巢對側(cè)新鮮比較，移植后各組卵泡總正常率(THR)及各級卵泡正常率(HR)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。但每組對側(cè)新鮮卵巢卵泡總正常率與移植后卵泡總正常率差值(D-value)隨著移植時(shí)間推移呈現(xiàn)有意義上升的趨勢(P＜0.05)。其中，1D組的D-value顯著低于1M組(7.05±0.65 vs.17.30±1.87，P＜0.05)。同時(shí)，D-

6、value在1D組和3D組之間，1W組和2W組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　二.PCNA的表達(dá)
　　各組移植后卵巢組織均可觀察到PCNA的表達(dá)，原始卵泡少量表達(dá)，初級以上卵泡大量表達(dá)。移植各組原始及初級卵泡陽性表達(dá)率分別與其對側(cè)新鮮比較均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。同時(shí)，1D組的原始及初級卵泡陽性表達(dá)率與3D組相似（P＞0.05），但從第7天開始，原始卵泡陽性表達(dá)率顯著高于1D及3D組（P＜0.05），而初級

7、卵泡陽性表達(dá)率相比1D及3D組呈現(xiàn)顯著的降低(P＜0.05)。1W，2W，1M組原始卵泡及初級卵泡陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　三.TUNEL分析
　　各移植組及新鮮卵巢組織（新鮮組:1244顆卵泡，1D組:789顆卵泡，3D組:1006顆卵泡，1W組:624顆卵泡，2W組:693顆卵泡，1M組:654顆卵泡）均極少觀察到TUNEL的陽性表達(dá)。其中，TUNEL陽性細(xì)胞主要分布在竇卵泡及早期閉鎖卵泡，偶爾可觀察

8、到小卵泡陽性表達(dá)。在計(jì)數(shù)的陽性大卵泡中，各組陽性表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　四.免疫雙色熒光檢測Patched和GLI的表達(dá)
　　移植后各組卵巢組織均觀察到有Patched和GLI的陽性表達(dá)，在各級卵泡的卵泡漿內(nèi)或顆粒細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)紅色、綠色熒光，但新鮮組呈陰性。同時(shí)各組熒光信號強(qiáng)度相當(dāng)。
　　五.各基因的mRNA的表達(dá)
　　移植后各組PCNA的mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)有意義的下降趨勢(P＜0.05)，其

9、中1D組PCNA的mRNA表達(dá)與3D組無差異(P＞0.05)，這與免疫組化結(jié)果一致。同時(shí)移植后各組卵巢Patched和GLI的mRNA表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，這與免疫雙色熒光結(jié)果一致。并且移植后各組在凋亡基因Caspase-3，Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)上仍舊無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.移植各組無論在形態(tài)學(xué)，增殖，凋亡方面與其對側(cè)新鮮比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，充分表明全卵巢移植所致短時(shí)缺血在

10、早期對卵泡生存狀態(tài)的影響甚小，至少1月內(nèi)是如此。另外充分證明了本實(shí)驗(yàn)的全卵巢移植血管吻合技術(shù)的建立和應(yīng)用是可行的。
　　2.移植各組組間比較發(fā)現(xiàn)隨著移植時(shí)間推移，卵泡總正常率呈現(xiàn)下降趨勢，逐漸出現(xiàn)卵泡異常數(shù)量增加;原始卵泡PCNA的表達(dá)呈現(xiàn)上升的趨勢，表明缺血缺氧同時(shí)也刺激了原始卵泡的增殖。
　　3.無論從組織學(xué)檢查還是PCNA表達(dá)均發(fā)現(xiàn)1W組的卵泡正常率及原始卵泡的陽性表達(dá)率均與1D組和3D組有顯著差異，表明7天后缺血對卵

11、泡影響逐漸顯現(xiàn)，7天是移植的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。在7天內(nèi)對移植進(jìn)行干預(yù)（藥物干預(yù)）有可能降低缺血對卵泡生存的影響。
　　4.免疫雙色熒光檢測Patched和GLI的表達(dá)發(fā)現(xiàn)移植各組均有Patched、GLI的表達(dá)，而新鮮對照組呈陰性。同時(shí)實(shí)時(shí)熒光PCR顯示移植各組Patched、GLImRNA的表達(dá)無明顯差異，表明移植過程中Hedgehog通路被激活，也許是應(yīng)對缺血對卵泡損害的一種保護(hù)機(jī)制。
　　5.本研究所建立的卵巢血管吻合移