光誘導(dǎo)香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成機(jī)理的研究.pdf

1、香菇是目前世界上一種深受消費(fèi)者喜歡的重要食用菌品種,其在世界范圍的生產(chǎn)量和消費(fèi)量排名僅次于雙孢蘑菇之后,是第二大食藥用菌品種。香菇栽培周期至少可以分為四個重要階段,分別為營養(yǎng)菌絲生長階段、菌絲轉(zhuǎn)色形成階段、原基形成階段、子實體生長階段。香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成是原基發(fā)生和子實體形成前重要階段,對香菇的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用,但香菇發(fā)育過程中菌絲轉(zhuǎn)色形成的機(jī)制還知之甚少,尤其是環(huán)境因子比如光對香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成的影響還未見報道。為了深入分析和闡明香

2、菇菌絲轉(zhuǎn)色形成的分子機(jī)制,本論文從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平系統(tǒng)分析光誘導(dǎo)香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成的機(jī)理。這是首次對香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成進(jìn)行系統(tǒng)研究,為這種具有重要商業(yè)價值的食用菌的子實體發(fā)育的分子機(jī)制的深入研究打下一基礎(chǔ),對研究香菇的生長發(fā)育及其次級代謝也具有重要意義。
　　本論文從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平,分析了光對香菇菌絲轉(zhuǎn)色的影響,并挖掘其相應(yīng)的候選基因和蛋白,解析了香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成的機(jī)制,主要結(jié)果如下:
　　第一、通過在完全避光條件下培

3、養(yǎng)香菇菌絲30天,菌絲發(fā)滿菌包,并且菌絲均為白色,再通過在兩種不同條件下(有光和避光)進(jìn)行平行培養(yǎng)(后熟),其中在有光條件下,香菇菌絲逐漸形成轉(zhuǎn)色,而在避光條件下,香菇菌絲未發(fā)生轉(zhuǎn)色現(xiàn)象,即仍為白色。培養(yǎng)試驗結(jié)果表明,光對香菇菌絲轉(zhuǎn)色的形成具有重要作用。
　　第二、香菇菌絲經(jīng)過30天黑暗發(fā)菌培養(yǎng)后,菌絲長滿菌包,再進(jìn)行見光和黑暗兩種處理進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)以考察轉(zhuǎn)色情況,其中分別對黑暗培養(yǎng)30天,以及后續(xù)培養(yǎng)50天兩種試驗處理的的菌包表層

4、香菇菌絲作為試驗樣品,其樣品編號分別為樣品118,313W以及313C。再利用新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)分別對三個試驗樣品進(jìn)行測序,共獲得了約159.23 million reads,通過從頭組裝得到了31,511unigenes,其中unigenes的平均長度為1,746 bp其N50為2,480 bp。將得到的unigenes應(yīng)用BLASTx與NR, SwissProt, COG以及KEGG庫進(jìn)行注釋與比對,其中有

5、24,246(76.94％)unigenes有注釋結(jié)果。通過比較313C/118和313C/313W的表達(dá)譜,分別獲得3958和5651顯著差異表達(dá)基因。通過比較和COG庫注釋等分析,揭示出與光誘導(dǎo)香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成相關(guān)的候選基因,這些基因編碼的蛋白主要包括光感受器(如WC-1, WC-2,phytochrome),光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如two-component phosphorelay system, mitogen-activated

6、protein kinase pathway),以及色素形成基因(如polyketide synthase,O-methyltransferase, laccase, P450-monooxygenase, oxidoreductase)等,在此基礎(chǔ)上,我們初步構(gòu)建了光誘導(dǎo)菌絲轉(zhuǎn)色的分子模型。同時,應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行了驗證。
　　第三、以見光轉(zhuǎn)色的香菇菌絲轉(zhuǎn)色的樣品(313C)與避光未轉(zhuǎn)色的香菇菌絲樣品

7、(313W)為材料,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的手段,即采用蛋白質(zhì)雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術(shù)比較分析了兩種處理條件下香菇菌絲的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。通過雙向電泳分離出700個左右銀染的蛋白質(zhì)點(diǎn),其中有73個蛋白質(zhì)點(diǎn)有顯著差異。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)酶解和質(zhì)譜鑒定,最終鑒定出52個蛋白質(zhì),其中有32個蛋白質(zhì)在樣品轉(zhuǎn)色的香菇菌絲中表現(xiàn)為上調(diào),其主要包括核苷二磷酸激酶、錳離子超氧化歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶

8、、蛋白酶成分PTS1、熱休克蛋白70、20S蛋白酶體亞基、S短鏈脫氫酶/還原酶 SDR、脂肪酶、腺苷激酶、3-異丙基脫氫酶、酮還原酶等;20個蛋白質(zhì)為下調(diào),主要包括琥珀酸半醛脫氫酶、林可霉素冷凝蛋白LMBA、乙二醛I、天門冬氨酸激酶絲氨酸脫氫酶、增殖相關(guān)2G4、三肽肽酶A和碳水化合物結(jié)合模塊系列13蛋白等。根據(jù)其主要功能,可將其分為能量代謝相關(guān)酶類、核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、伴侶等

9、相關(guān)類型。通過蛋白質(zhì)組初步分析,我們發(fā)現(xiàn)由光誘導(dǎo)香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成,可能依賴于光信號傳導(dǎo)的蛋白。蛋白NDK的顯著上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步說明涉及光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控的蛋白質(zhì)在光誘導(dǎo)香菇菌絲轉(zhuǎn)色形成過程中起著重要作用。此外,推測其能調(diào)節(jié)信號介導(dǎo)的色素等相關(guān)代謝合成基因的表達(dá),從而完成香菇菌絲的轉(zhuǎn)色。本研究結(jié)果為香菇的功能基因組學(xué)的深入分析研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　第四、通過香菇菌絲的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR分子標(biāo)記篩選和分析,結(jié)果表明,有2474個Uni