小腸粘膜下層在氣管前壁缺損修復(fù)中的應(yīng)用及氣管纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、喉氣管瘢痕性狹窄切除后常遺留大段缺損，治療棘手。近年來隨著交通、工礦等事故增加，發(fā)病率有增加趨勢(shì)。喉氣管功能重建術(shù)關(guān)鍵要處理以下幾個(gè)問題：1.喉氣管黏膜上皮再生與修復(fù)；2.如何控制瘢痕增生；3.喉氣管軟骨支架修復(fù)；4.組織工程軟骨構(gòu)建研究。 嚴(yán)重的喉氣管狹窄重建喉氣管軟骨支架、增寬喉氣管腔是成功的關(guān)鍵。重建支架有自體組織，同種異體材料、合成材料等。自體組織有肋軟骨、鼻中隔軟骨、舌骨、旋轉(zhuǎn)帶狀肌皮瓣、胸鎖乳突肌鎖骨膜瓣等，是臨床應(yīng)

2、用最多、安全、有效的材料。主要缺點(diǎn)是增加供區(qū)創(chuàng)傷，取材有限，增加病人痛苦。因此應(yīng)用替代材料的研究前景廣闊。同種異體材料優(yōu)點(diǎn)是材料來源廣泛，主要需解決的問題有：①如何保存材料的活性。②如何解決免疫排斥反應(yīng)。我科既往實(shí)驗(yàn)用組織培養(yǎng)RPMI-1640保存軟骨180天仍保有較好活性，軟骨細(xì)胞活性率保持在90％以上。用此培養(yǎng)的軟骨進(jìn)行同種異體移植能修復(fù)甲狀軟骨缺損。 Surgisis(Cook)是一種已商品化的無細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，一般取自

3、豬小腸黏膜下層(smallintestinalsubmucosa，SIS)，已廣泛應(yīng)用于臨床的胸腹壁、膈疝、骨盆底及膀胱壁缺損的修復(fù)[1,2]，并有人將其應(yīng)用于兔氣管的致命性狹窄修復(fù)，發(fā)現(xiàn)有纖毛柱狀上皮附著于SIS補(bǔ)片表面[3]。 近年來，組織工程化氣管的研究日益受到重視，要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)有活性的組織工程氣管替代物，具有氣管上皮的功能，尤其是纖毛運(yùn)輸固體顆粒和液體的能力，是氣管重建中必須考慮的問題，但到目前為止，該問題尚未得到有效的解

4、決。因此，研究建立氣管纖毛上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型使其成為組織工程氣管種子細(xì)胞具有重要的臨床意義。呼吸道上皮培養(yǎng)技術(shù)國(guó)外已發(fā)展多年，因其生長(zhǎng)條件苛刻，國(guó)內(nèi)研究較少，且培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟。 本研究自制兔SIS，觀察其生物相容性，評(píng)估自制SIS復(fù)合不同的經(jīng)組織培養(yǎng)的異體軟骨修復(fù)大塊氣管前壁缺損的可能性，并初步探索在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下的氣管纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)。 目的1.比較兩種制備方法所獲兔小腸黏膜下層(SIS)的異同，為將SIS作為組織

5、工程細(xì)胞載體選擇最佳制備方案；通過SIS與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察軟骨細(xì)胞在SIS上的生長(zhǎng)特性，為使SIS作為軟骨組織工程化的載體打下基礎(chǔ)。 2.評(píng)估小腸黏膜下層復(fù)合不同的經(jīng)組織培養(yǎng)的異體軟骨修復(fù)大塊氣管前壁缺損的可能性。 3.探討建立兔氣管纖毛上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，觀察其體外培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性。 方法1.小腸黏膜下層制備及其與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究分別用消毒法和順序化學(xué)脫細(xì)胞法處理機(jī)械剝離獲取的兔小腸黏膜下層

6、，進(jìn)行組織學(xué)、掃描電鏡檢查及MTT(四氮唑鹽)細(xì)胞毒性對(duì)比實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的兔軟骨細(xì)胞與SIS進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，分別進(jìn)行組織學(xué)、倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察。 2.小腸黏膜下層復(fù)合軟骨修復(fù)氣管前壁缺損的實(shí)驗(yàn)研究取成年新西蘭兔，行氣管前壁4至6環(huán)全層缺損造模(缺損4mm×8mm約占?xì)夤墉h(huán)1/3)。取自制的小腸黏膜下層8片，分別包裹經(jīng)組織培養(yǎng)的異體甲狀軟骨(實(shí)驗(yàn)組1)、耳廓軟骨(實(shí)驗(yàn)組2)及單純小腸黏膜下層(實(shí)驗(yàn)組3)修整為5mm×9m

7、m，用4-0無損傷縫線間斷縫合至氣管缺損封閉缺損。對(duì)照組缺損用氣管前筋膜封閉。對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行觀察，出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難或生存至4周及12周時(shí)處死并切取氣管行常規(guī)病理檢查。 3.兔氣管黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性利用低溫酶消化法分離獲取兔氣管纖毛上皮細(xì)胞，無血清生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，抗角蛋白單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色及掃描電鏡驗(yàn)證纖毛上皮細(xì)胞特性。 結(jié)果1.小腸黏膜下層制備及其與軟骨細(xì)胞共培

8、養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究組織學(xué)及電鏡掃描顯示：與消毒法相比，經(jīng)順序化學(xué)浸泡脫細(xì)胞處理的SIS純度高，孔隙多，安全性高，膠原纖維未受損；浸提液MTT檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)增殖率均大于1，100％SIS浸提液各組與對(duì)照組吸光值均有顯著性差異(P≤0.01)，相同濃度不同SIS浸提液組間無顯著性差異，表明多種化學(xué)試劑的SIS對(duì)軟骨細(xì)胞不增加毒性，有一定促生長(zhǎng)作用；軟骨細(xì)胞在SIS材料上生長(zhǎng)、黏附、增殖，并能長(zhǎng)入材料的孔隙內(nèi)，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分。

9、2.小腸黏膜下層復(fù)合軟骨修復(fù)氣管前壁缺損的實(shí)驗(yàn)研究所有動(dòng)物未出現(xiàn)手術(shù)意外，但實(shí)驗(yàn)組1(n=5)中的兩只、實(shí)驗(yàn)組2(n=5)中的三只及實(shí)驗(yàn)組3(n=5)中的三只在術(shù)后出現(xiàn)進(jìn)行性喘鳴存活不到一月并有不同程度的氣管腔阻塞。實(shí)驗(yàn)組的其它動(dòng)物和對(duì)照組(n=3)均存活超過一月，病理切片顯示SIS修復(fù)的缺損被覆纖毛上皮細(xì)胞，移植的異體軟骨有不同程度降解。 3.兔氣管黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性所獲細(xì)胞圓形，較大，懸浮旋轉(zhuǎn)；接種24h后貼壁，

10、6～8天聯(lián)結(jié)成片，細(xì)胞形態(tài)多樣，部分細(xì)胞可見纖毛活動(dòng)，抗角蛋白單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色陽性，掃描電鏡下見氣管上皮細(xì)胞特征。 結(jié)論1.化學(xué)脫細(xì)胞法較消毒法制備的SIS的安全性好，易保存，操作性強(qiáng)，所得SIS是一種較理想的軟骨細(xì)胞載體，其細(xì)胞相容性良好，不影響軟骨細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能表達(dá)無抑制作用，是一種較理想的軟骨細(xì)胞載體。 2.SIS及其與經(jīng)組織培養(yǎng)的異體軟骨復(fù)合物可以應(yīng)用于兔氣管前壁大塊缺損的修復(fù)，SIS有利