金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：四環(huán)類(lèi)抗生素最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代末，是一種很好的快速抑菌劑。其作用機(jī)理主要是和細(xì)菌30S核糖體的末端結(jié)合，從而阻止肽鏈延伸和細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。由于其具有廣譜、使用方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，已被開(kāi)發(fā)為獸用抗生素和飼料添加劑，目前在畜牧業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用。金色鏈霉菌是四環(huán)素工業(yè)生產(chǎn)用菌，為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，其菌種改良成為鏈霉菌工業(yè)的重要攻關(guān)課題之一。多年以來(lái)，基于理化誘變和分離篩選的傳統(tǒng)育種方法在鏈霉菌生產(chǎn)菌種的改良方面取

2、得了顯著的成績(jī)，但隨著產(chǎn)量水平的提高，傳統(tǒng)方法的局限性越發(fā)明顯。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，已能在基因水平對(duì)菌種進(jìn)行改造，通過(guò)導(dǎo)入外源基因，有目的地改造菌種的代謝途徑，實(shí)現(xiàn)菌種選育的理性化，甚至產(chǎn)生新的化合物。在基因水平對(duì)一個(gè)鏈霉菌進(jìn)行改造的首要的問(wèn)題就是建立所研究菌株的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。目前，有關(guān)金色鏈霉菌轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，而高產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn)菌株，由于已經(jīng)過(guò)了多輪誘變處理，與野生菌種又有很大不同。本研究探索建立了四環(huán)素工業(yè)生產(chǎn)菌株

3、的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種改良奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的制備和再生； 2.金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株耐藥性調(diào)查，確定篩選標(biāo)記； 3.PEG-介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化金色鏈霉菌原生質(zhì)體； 4.接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立； 5.電轉(zhuǎn)化； 6.陽(yáng)性克隆的PCR鑒定分析。 結(jié)果：通過(guò)試驗(yàn)確定了金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株4-6的原生質(zhì)體制備和再生條

4、件：菌絲體培養(yǎng)選擇加2％甘氨酸的S培養(yǎng)基，采用一級(jí)培養(yǎng)法，30℃培養(yǎng)20h，收獲菌絲體；制備原生質(zhì)體時(shí)，溶菌酶的濃度為2％，酶解溫度控制在35℃，酶解時(shí)間為1.5～2.0h；原生質(zhì)體再生選用原固體培養(yǎng)基加0.2mol/L，的蔗糖，平皿要保持干燥，35℃再生培養(yǎng)，再生率最高為16.97％。 嘗試用整合型質(zhì)粒pZMW和穿梭型質(zhì)粒pZM分別轉(zhuǎn)化金色鏈霉菌4-6原生質(zhì)體，均未成功?？疾炝司z培養(yǎng)時(shí)間、原生質(zhì)體和質(zhì)粒的濃度、PEG分子量和

5、濃度、緩沖液、抗性選擇時(shí)間等因素對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，也對(duì)定位于細(xì)胞膜的DNase進(jìn)行了滅活處理，也都沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功。說(shuō)明金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株對(duì)外源DNA有很強(qiáng)的限制作用。 接合轉(zhuǎn)移和電轉(zhuǎn)化可以克服某些鏈霉菌的限制修飾系統(tǒng)。但電轉(zhuǎn)化在實(shí)驗(yàn)條件下也是不成功的。 利用大腸桿菌ET12567(PUZ8002)和雙功能質(zhì)粒載體pZMW后，探索了通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法從大腸桿菌向金色鏈霉菌轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的可能性。經(jīng)接合轉(zhuǎn)移操作后的平皿用1ml含有萘

6、啶酸(作用濃度均為50ug/ml)和氨普霉素(作用濃度為30ug/ml)的水溶液覆蓋，再生的菌落經(jīng)PCR鑒定分析，即為陽(yáng)性克隆。 結(jié)論：金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株對(duì)外源DNA有很強(qiáng)的限制作用。常規(guī)的PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法不能將外源DNA導(dǎo)入該菌體中，盡管電轉(zhuǎn)化法可以克服鏈霉菌的某些限制修飾系統(tǒng)，但在實(shí)驗(yàn)條件下，也不能獲得轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)建立了金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株經(jīng)濟(jì)、快捷的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)--接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。用含有oriT的大腸桿菌