大腸桿菌表達(dá)片球菌素的純化工藝及其理化特性的研究.pdf

1、本實驗室已將乳酸片球菌素pedA基因與pMD18-T載體和表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)連接所構(gòu)成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)基因工程菌中,構(gòu)成了用大腸桿菌表達(dá)片球菌素的表達(dá)系統(tǒng)。本研究旨在研究在E.coli BL21(DE3)基因工程菌表達(dá)片球菌素的分離純化和理化性質(zhì)。
　　 本研究對兩種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)E.coli BL21(DE3)基因工程菌表達(dá)片球菌融合蛋白——使用IPTG誘導(dǎo)和使用ZYM-5052培養(yǎng)基自動

2、誘導(dǎo)進(jìn)行了比較,結(jié)果表明使用ZYM-5052培養(yǎng)基自動誘導(dǎo)的表達(dá)效果優(yōu)于IPTG誘導(dǎo),自動誘導(dǎo)最終菌液的OD600在7左右,而IPTG誘導(dǎo)只有3左右,產(chǎn)生的包涵體蛋白在相同條件下溶解,自動誘導(dǎo)的蛋白濃度為0.2359mg／ml,而IPTG誘導(dǎo)只有0.1001mg／ml。
　　 由于E.coli BL21(DE3)基因工程菌的高效表達(dá),所形成的片球菌素融合蛋白的形式為包涵體,為了獲得具有活性的基因工程片球菌素,本研究對包涵體的提取

3、、溶解、和多種復(fù)性方法,包括稀釋復(fù)性、反稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、CTAB輔助復(fù)性和CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性等方法進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果表明,CTAB和βp—CD結(jié)合輔助復(fù)性的復(fù)性方法優(yōu)于其它的復(fù)性方法,可以實現(xiàn)較高的初始變性蛋白濃度,較小的復(fù)性液體積和達(dá)到相對穩(wěn)定的復(fù)性率。為了實現(xiàn)基因工程片球菌素的分離純化,將復(fù)性后并濃縮到一定體積基因工程片球菌素在腸激酶緩沖液中用腸激酶處理,可以實現(xiàn)基因工程片球菌素和硫氧還蛋白的分離,基因工程片球菌素

4、帶有His標(biāo)簽,將酶切后蛋白溶液注入Ni-MDA親和重力柱,在500mmol／L咪唑的條件下可以被洗脫下來。洗脫的最高蛋白濃度達(dá)到0.014mg／ml。
　　 本研究對基因工程片球菌素的抑菌活性和部分理化性質(zhì)如熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性、酶敏感性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明基因工程片球菌素對植物乳桿菌,單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有抑菌作用?；蚬こ唐蚓氐臒岱€(wěn)定性較好,經(jīng)121℃高壓處理后仍顯示出部分抑菌活性,在pH值1-7范圍內(nèi)活性穩(wěn)定,pH