半導(dǎo)體激光預(yù)照射對(duì)經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ㄉ飳W(xué)效應(yīng)的影響.pdf

1、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?transpupillary thermotherapy，TTT)是近年來用于治療脈絡(luò)膜新生血管的一種激光療法。該治療方法的特點(diǎn)是采用低能量、大光斑、長(zhǎng)時(shí)間照射，使局部組織低升溫，來達(dá)到使脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)消退，又不對(duì)周圍組織造成損傷的目的。但目前對(duì)于TTT治療的機(jī)理卻了解甚少。許多學(xué)者曾對(duì)TTT照射后的組織進(jìn)行病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)存在熱休克蛋白高表達(dá)、細(xì)

2、胞凋亡等現(xiàn)象，推測(cè)其可能的機(jī)理是組織低升溫，使CNV血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)低升溫促使熱休克蛋白高表達(dá)，減少了熱能對(duì)周圍組織的損傷。 本文前兩部分通過對(duì)正常大鼠視網(wǎng)膜或體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞行較高能量半導(dǎo)體激光(diode laser，DL)照射前，先予一次低能量DL預(yù)照射，探討DL預(yù)照射對(duì)受照射組織熱休克蛋白表達(dá)的影響以及對(duì)視網(wǎng)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞可能產(chǎn)生的作用。第三部分建立非激光誘導(dǎo)的色素兔CNV模型，為今后進(jìn)一步探討TTT治療

3、的安全性及有效性提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 第一部分：DL預(yù)照射對(duì)視網(wǎng)膜保護(hù)作用的探討 目的：低能量DL預(yù)照射大鼠視網(wǎng)膜20小時(shí)后再進(jìn)行較高能量DL照射，探討DL預(yù)照射是否對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層存在保護(hù)效應(yīng)，并討論該過程中視網(wǎng)膜Hsp70高表達(dá)的相關(guān)性。 對(duì)象與方法：26只挪威棕色大鼠按照隨機(jī)原則分為5組。A組：DL低能量(60 mW)預(yù)照射視網(wǎng)膜20小時(shí)后予第二次DL高能量(80 mW)照射，12小時(shí)后觀察。B組：未予低能量

4、DL預(yù)照射，直接行高能量照射，12小時(shí)后觀察。C組：只予DL低能量照射，36小時(shí)后觀察。D組：除未行DL照射外，其余操作均同A、B、C組。E組：空白對(duì)照。所有各組的觀察指標(biāo)均為：眼底檢查、FFA、ICGA檢查，以及病理學(xué)檢查，并通過免疫組化、原位雜交以及Western B10t蛋白質(zhì)半定量法檢測(cè)視網(wǎng)膜Hsp70表達(dá)；以TUNEL法原位檢測(cè)視網(wǎng)膜組織內(nèi)凋亡，免疫組化法與Western B10t蛋白質(zhì)半定量法檢測(cè)視網(wǎng)膜活性Caspase 3

5、表達(dá)。 結(jié)果：各組大鼠眼底檢查均無異常，F(xiàn)FA檢查可見B組少量光斑存在熒光素滲漏，ICGA未見熒光染料積存。各組視網(wǎng)膜切片HE染色也未見組織結(jié)構(gòu)改變，光鏡、電鏡下均未見組織壞死。免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示：各組視網(wǎng)膜Hsp70表達(dá)陽(yáng)性，以內(nèi)、外叢狀層為主，DL照射組顯著高于對(duì)照組，其中A組視網(wǎng)膜Hsp70表達(dá)明顯高于B組、C組。Westerrl Blot結(jié)果與此一致。原位雜交法檢測(cè)結(jié)果視網(wǎng)膜內(nèi)、外叢狀層Hsp70 mRNA陽(yáng)性表達(dá)

6、。TUNEL結(jié)果示DL照射后視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層(INL、ONL)均可見不同程度細(xì)胞凋亡，并且外核層更多見，其中B組INL、ONL細(xì)胞凋亡率明顯高于A組和C組，D、E兩對(duì)照組未見明顯凋亡。DL照射后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層活性Caspase 3免疫表達(dá)陽(yáng)性，Wrestem B1Ot結(jié)果示B組視網(wǎng)膜活性Caspase 3表達(dá)明顯高于A組和C組，對(duì)照組表達(dá)不明顯。 結(jié)論：DL照射眼底雖無肉眼可見視網(wǎng)膜損害，但視網(wǎng)膜INL、ONL存在細(xì)胞凋亡。

7、高能量(80 mW)DL照射前先予低能量(60 mW)DL預(yù)照射，能夠減輕高能量DL照射引起的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。這一保護(hù)效應(yīng)可能與低能量DL誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞自身保護(hù)性蛋白—Hsp70高表達(dá)，從而提高視網(wǎng)膜對(duì)熱的耐受能力有關(guān)。提示臨床對(duì)患者進(jìn)行TTT治療前1天先予一次低能量DL預(yù)照射，有可能減輕TTT治療對(duì)視網(wǎng)膜的損害。 第二部分：DL預(yù)照射對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 目的：探討在高能量DL照射血管內(nèi)皮細(xì)胞前先予一次低能量DL

8、預(yù)照射對(duì)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以及Hsp70高表達(dá)在此過程中可能產(chǎn)生的作用。 對(duì)象與方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV 304)。細(xì)胞內(nèi)加入ICG 15μg／ml后，分組予不同方式DL照射。A組：低能量(500 mW)DL預(yù)照射后20小時(shí)再行第二次高能量(900 mW)DL照射，12小時(shí)后觀察。B組：未予低能量DL預(yù)照射，直接予高能量DL照射后12小時(shí)進(jìn)行觀察。C組：只予低能量DL照射后36小時(shí)觀察。D組：除不予

9、DL照射外，其余操作均同A、B、C組。E組：空白對(duì)照。所有各組細(xì)胞的觀察指標(biāo)如下：光鏡、電鏡下觀察各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Hsp70表達(dá)。并收集細(xì)胞抽提總蛋白，Wrestem B1ot蛋白質(zhì)半定量檢測(cè)Hsp70在細(xì)胞內(nèi)的含量。同時(shí)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率、凋亡率與壞死率。免疫細(xì)胞化學(xué)法及Westem Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性Caspase 3的含量。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果B組細(xì)胞壞死率(47.21％)明顯多于A組

10、(21.45％)和C組(1.49％)，B組細(xì)胞凋亡率(18.34％)顯著少于A組 (41.22％)，C組凋亡率(7.20％)與正常對(duì)照相近。D、E組凋亡、壞死均不明顯(凋亡率分別為5.14％、2.98％，壞死率分別為1.55％、O.96％)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示胞漿內(nèi)活性Caspase 3表達(dá)陽(yáng)性。Westem B10t法結(jié)果示活性Caspase 3含量：B組明顯低于A組。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不：DL照射組細(xì)胞胞漿內(nèi)Hsp70強(qiáng)陽(yáng)性，其

11、中A組明顯高于B組，對(duì)照組細(xì)胞胞漿內(nèi)Hsp70弱陽(yáng)性。Western Blot結(jié)果示：Hsp70表達(dá)可見于所有細(xì)胞，但DL照射組明顯高于對(duì)照組，且A組明顯高于B組。 結(jié)論：低能量(500 roW)DL預(yù)照射后再予高能量(900 mW)DL照射體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，能夠顯著減少細(xì)胞壞死，從而減少細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)釋放導(dǎo)致的局部炎性反應(yīng)。該效應(yīng)可能與低能量DL誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Hsp70高表達(dá)，抗細(xì)胞壞死作用有關(guān)。提示：臨床采用TTT治療C

12、NV前l(fā)天，先予一次低能量DL預(yù)照射，有可能減輕TTT治療時(shí)引發(fā)的局部炎性反應(yīng)，從而減少CNV再形成的可能。 第三部分：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)色素兔脈絡(luò)膜新生血管形成 目的：探討堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)青紫蘭色素兔脈絡(luò)膜新生血管模型的方法及可行性，嘗試建立脈絡(luò)膜新生血管的非激光誘導(dǎo)模型。 方法：健康成年青紫蘭色素兔40只，隨機(jī)分為二組。A組為實(shí)驗(yàn)組，視網(wǎng)膜下注入0.005％(wt/v01)bF

13、GF 50μl，B組為對(duì)照組，視網(wǎng)膜下注入0.9％生理鹽水50μl，對(duì)側(cè)眼都作空白對(duì)照，不行視網(wǎng)膜下注射。視網(wǎng)膜注射后3天，1、2、3、4、6、8、12周分別行眼底檢查、FFA、ICGA，并行眼球組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：視網(wǎng)膜下注射后所有眼均即見視網(wǎng)膜直徑4-5PD青灰色半球形隆起，A組與B組隆起的視網(wǎng)膜分別于注射后2周和1周左右平復(fù)。視網(wǎng)膜下注射bFGF后2-12周FFA檢查可見原注射隆起處下方造影早期出現(xiàn)斑點(diǎn)狀高熒，后期高

14、熒斑逐漸融合擴(kuò)大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。ICGA顯示FFA高熒相應(yīng)部位熒光染料積存。對(duì)照眼FFA、ICGA檢查均未見明顯高熒灶或熒光染料積存。病理檢查結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜下注射bFGF后2-12周，視網(wǎng)膜下有脈絡(luò)膜新生血管形成。 結(jié)論：視網(wǎng)膜下注入具有生物活性的bFGF能夠成功誘導(dǎo)色素兔脈絡(luò)膜 新生血管形成。該動(dòng)物模型可重復(fù)性較好，能夠模擬人眼CNv的病理狀態(tài)，可用作研究CNV的疾病轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)安全有效的防治手段的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，尤其適