3種抗瘤中藥制劑影響Hela細胞免疫抑制分子分泌的研究.pdf

1、目的：宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，全球每年約有20萬婦女死于此病，嚴重威脅著婦女的健康及生活質量。目前，在傳統(tǒng)的三大療法基礎上，宮頸癌的輔助免疫治療已成為近年來的研究熱點。腫瘤細胞分泌免疫抑制分子抑制免疫功能逃避免疫監(jiān)視，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細胞培養(yǎng)上清具有免疫抑制作用，是其分泌免疫抑制分子所致，報道較多的是轉化生長因子(TGF)β、白介素(IL)10及前列腺素(PG)E2等。因此，研究下調腫瘤免疫抑制分子分泌，

2、尋找能夠逆轉腫瘤免疫抑制的有效藥物，是開發(fā)抗瘤藥物、明確其抗瘤免疫機理和指導臨床合理應用的重要方面。中藥抗腫瘤是我國抗瘤藥物研究的優(yōu)勢領域，本實驗選用宮頸癌Hela細胞，檢測其經(jīng)3種抗瘤中藥制劑分別作用后免疫抑制分子分泌的變化，初步探討不同類型中藥制劑下調腫瘤免疫抑制與影響腫瘤細胞分泌免疫抑制分子類別的規(guī)律，為揭示抗瘤中藥作用新機制，進一步開發(fā)具有我國自己特色和自主知識產(chǎn)權的抗瘤中藥制劑，指導臨床合理應用，奠定實驗基礎和提供理論依據(jù)。

3、 方法：確定最適宜的腫瘤細胞接種濃度及培養(yǎng)時間后，選用川芎嗪(LHC)、氧化苦參堿(MOX)、青蒿琥酯(ART)3種抗瘤中藥制劑，MTT法篩選對腫瘤細胞無直接毒性的最高中藥濃度。分別制備不同中藥制劑作用48h后的培養(yǎng)上清(分別稱為LHC-S、MOX-S、ART-S)，洗滌去除中藥制劑，再連續(xù)兩次用新鮮培液進行48h再培養(yǎng)的Hela細胞上清(分別稱為LHC-S1、MOX-S1、ART-S1；LHC-S2、MOX-S2、ART-S2)

4、，以及不經(jīng)中藥制劑作用的相應同步培養(yǎng)的Hela細胞培養(yǎng)上清作對照(分別稱為Control-S、Control-S1、Control-S2)。定量ELISA法測定各上清中TGF-β1、IL-10的含量，紫外分光光度法測定PGE2的A278值。將中藥制劑作用后再培養(yǎng)的Hela細胞免疫抑制分子含量列表進行統(tǒng)計分析，確定抗瘤中藥制劑下調Hela細胞免疫抑制的相應靶分子。 結果：1經(jīng)MTT法確定實驗用Hela細胞接種濃度為2×105/mL

5、，培養(yǎng)時間為48h；2經(jīng)MTT法確定實驗用對腫瘤細胞無直接毒性作用的中藥制劑最高濃度分別為：LHC7.80mg/L、MOX39.06mg/L、ART3.13mg/L；3未經(jīng)中藥制劑作用的Hela細胞可穩(wěn)定分泌所測的3種免疫抑制分子，以TGF-β1含量最高，可達(989.226±34.836)ng/mL，IL-10的含量為(3.768±0.145)pg/mL，檢測PGE2的A278值為(0.262±0.037)。經(jīng)LHC作用后，LHC-S

6、與Control-S相比，TGF-β1、IL-10的含量及PGE2的A278值均明顯降低(分別為18.791±2.368，P＜0.001；2.982±0.117，P＜0.05；0.148±0.037，P＜0.05)，以TGF-β1降低最著，僅為Control-S含量的1.90％，IL-10為Control-S含量的87.90％，PGE2為Control-S A278值的56.49％；其第一次48h再培養(yǎng)上清(LHC-S1)與LHC-S相

7、比，TGF-β1含量繼續(xù)顯著降低(2.398±0.458，P＜0.01)，僅為Control-S1的0.25％，IL-10含量無明顯變化(2.871±0.108，P＞0.05)，PGE2的A278值繼續(xù)顯著降低(0.091±0.007，P＜0.01)，為Control-S1的34.73％；其第二次48h再培養(yǎng)上清(LHC-S2)與LHC-S1相比，TGF-β1含量仍繼續(xù)顯著降低(0.595±0.031，P＜0.001)，僅為Contro

8、l-S2中含量的0.06％，IL-10含量開始顯著回升(3.232±0.116，P＜0.05)，但未達到Control-S2對照水平，PGE2的A278值開始顯著回升(0.144±0.042，P＜0.05)，為Control-S2的56.25％。經(jīng)MOX作用后的Hela細胞，MOX-S與Control-S相比，TGF-β1含量明顯降低(2.561±0.789，P＜0.001)，僅為Control-S含量的0.26％，IL-10含量及PG

9、E2的A278值無顯著變化(分別為3.304±0.085，P＞0.05；0.215±0.057，P＞0.05)；其第一次48h再培養(yǎng)上清(MOX-S1)與MOX-S相比，TGF-β1含量繼續(xù)顯著降低(0.305±0.035，P＜0.001)，僅為Control-S1含量的0.03％，IL-10含量及PGE2的A278值無顯著變化(分別為3.492±1.008，P＞0.05；0.186±0.045，P＞0.05)；其第二次48h再培養(yǎng)上清

10、(MOX-S2)與MOX-S1相比，TGF-β1含量顯著回升(1.382±0.389，P＜0.001)，為Control-S2含量的0.14％，IL-10含量及PGE2的A278值無顯著變化(分別為3.047±0.239，P＞0.05；0.151±0.035，P＞0.05)。經(jīng)ART作用后的Hela細胞，ART-S與Control-S相比，TGF-β1的含量明顯降低(2.859±0.520，P＜0.001)，僅為Control-S含量的

11、0.29％，IL-10的含量顯著降低(3.010±0.217，P＜0.05)，為Control-S含量的88.76％，PGE2的A278值顯著降低(0.149±0.013，P＜0.05)，為Control-S的58.43％；其第一次48h再培養(yǎng)上清(ART-S1)與ART-S相比，TGF-β1繼續(xù)降低(0.009±0.001，P＜0.001)，僅為Control-S1含量的0.00008％，IL-10的含量顯著降低(3.121±0.13

12、7，P＜0.05)，為Control-S1的90.99％，PGE2的A278值繼續(xù)顯著降低(0.138±0.032，P＜0.05)，為Control-S1的52.67％；其第二次48h再培養(yǎng)上清(ART-S2)與ART-S1相比，TGF-β1含量顯著回升(0.576±0.032，P＜0.001)，為Control-S2含量的0.06％，IL-10含量及PGE2的A278值無顯著變化(分別為3.207±0.082，P＞0.05:0.186

13、±0.013，P＞0.05)。 結論：1 Hela細胞可穩(wěn)定分泌所測3種免疫抑制分子。2所試的川芎嗪、氧化苦參堿及青蒿琥酯3種抗瘤中藥制劑均可下調Hela細胞分泌的免疫抑制分子TGF-β1的含量，其中以青蒿琥酯下調作用最強；川芎嗪和青蒿琥酯可下調IL-10及PGE2的含量，其中以川芎嗪下調作用最強。3 TGF-β1可能是Hela細胞的優(yōu)勢分泌免疫抑制分子。4下調腫瘤免疫抑制分子分泌可能是川芎嗪、氧化苦參堿及青蒿琥酯的抗瘤免疫作用