胃癌CD40+MDSC亞群的鑒定及生物學(xué)功能初步分析.pdf

1、目的：Gr-1+CD11b+髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制細(xì)胞,其在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因MDSC具異質(zhì)性,生物學(xué)作用復(fù)雜,限制了研究者們對(duì)MDSC全面深入的了解,因此鑒定MDSC細(xì)胞亞群是探討該群細(xì)胞生物學(xué)功能的重要前提。本研究擬鑒定MDSC亞群并探討其生物學(xué)功能,為胃癌免疫干預(yù)治療提供新的策略。
　　方法：腫瘤細(xì)胞系皮下種植構(gòu)建

2、C57BL/6小鼠荷瘤模型;流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟和腫瘤組織浸潤(rùn)MDSC的累積水平及其表面CD40的表達(dá)水平。體外功能實(shí)驗(yàn)中,以CD40激發(fā)型抗體刺激MDSC培養(yǎng)24hr后,以Gr-1抗體、CD11b抗體、Annexin V標(biāo)記,流式分析CD40信號(hào)對(duì)MDSC凋亡的影響率。采用流式細(xì)胞分選技術(shù)從胃癌荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞中分選出CD40+和CD40-Gr-1+CD11b+MDSC,細(xì)胞甩片技術(shù)離心涂片后,以Wright染色觀察兩亞群細(xì)

3、胞形態(tài);基因芯片技術(shù)篩選兩亞群關(guān)鍵差異性分子及信號(hào)通路的差異性,并以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)進(jìn)一步確認(rèn)基因芯片結(jié)果。
　　結(jié)果：(1)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠MDSC表達(dá)CD40分子,且表達(dá)水平高于正常小鼠。在胃癌模型中,隨著腫瘤的生長(zhǎng)荷瘤小鼠脾臟與腫瘤組織中MDSC的累積水平逐漸升高,而MDSC表面CD40的表達(dá)則逐漸降

4、低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson’s Correlation)顯示:脾臟及腫瘤組織中MDSC的累積水平均與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)(脾臟:r=0.9318,p<0.0001;腫瘤:r=0.9169,p<0.0001);MDSC表面CD40的表達(dá)水平與其累積水平呈負(fù)相關(guān)(脾臟:r=-0.8690,p=0.0002;腫瘤:r=-0.8673, p=0.0003)。凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD40激發(fā)型抗體能誘導(dǎo)MDSC凋亡,其中腫瘤組織浸潤(rùn)MDS

5、C的凋亡率(mean±SEM,％)由71.37±2.68被誘導(dǎo)至79.09±3.29,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0352);脾臟來(lái)源的MDSC凋亡率(mean±SEM,％)由25.43±10.45誘導(dǎo)至32.30±10.27,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0167)。(2)胃癌荷瘤小鼠脾臟中Gr-1+CD11b+MDSC以CD40為標(biāo)記分子可分為兩個(gè)亞群:CD40-MDSC和CD40+MDSC。形態(tài)學(xué)顯示CD40-MDSC以環(huán)形核、分葉核和

6、多形核幼稚的粒細(xì)胞為主,核質(zhì)比較大。CD40+MDSC多為圓形和橢圓形核,核質(zhì)比較大,主要是幼稚單核細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR提示與CD40-MDSC比較,CD40+MDSC分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10、IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)及精氨酸酶(arginase,Arg)水平增高,其中以PGE2(Foldchange=7.29)及Arg(Foldchange=3.12)的上調(diào)具有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Foldchange≥2.0)。除此之外,這兩群細(xì)胞一些重要免疫抑制表型及免疫趨化遷移分子的表達(dá)也具有廣泛差異,如CD83、FMS樣的酪氨酸激3(fms-like tyrosine kinase,FLT3)、CXC趨化因子配體10(CXCL10)、CXC趨化因子受體5(CXCR5)和CXC趨化因子配體9(CXCL9)在CD40+MDSC均顯著高于CD40-MDSC(Foldchange≥2.0)。
　　結(jié)論：(1)荷瘤

8、小鼠MDSC表面表達(dá)CD40分子,且其表達(dá)水平高于健康小鼠;然而在胃癌模型中CD40表達(dá)水平隨著腫瘤進(jìn)展逐漸降低,與MDSC的累積水平呈負(fù)相關(guān);CD40可誘導(dǎo)MDSC的凋亡,MDSC表面CD40的下調(diào)誘導(dǎo)了MDSC的抗凋亡,可能是參與調(diào)節(jié)MDSC累積的機(jī)制之一。提示在腫瘤早期,MDSC上CD40誘導(dǎo)表達(dá)可以促進(jìn)炎癥性反應(yīng),營(yíng)造適合胃癌生長(zhǎng)的炎性環(huán)境;隨著腫瘤進(jìn)展CD40不斷降低,CD40介導(dǎo)MDSC凋亡的作用逐漸減弱,導(dǎo)致MDSC逐漸累