白芍總苷在免疫性肝損傷動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究.pdf

1、目的：白芍為毛莨科植物芍藥的干燥根，具有養(yǎng)血柔肝、緩急止痛之功效。白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)是白芍根中提取的有效部位，主要含有芍藥苷（Paeoniflorin，Pae）、芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等成分，其中以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量最高。現(xiàn)代研究表明TGP對急、慢性化學(xué)性和免疫性肝纖維化坰有明顯的防治作用，但其在肝損傷病理狀態(tài)下的體內(nèi)過程尚

2、不清楚。本課題以HPLC法為手段追蹤芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷濃度，研究TGP在免疫性肝損傷動物和正常動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)特征，同時探討TGP在正常動物體內(nèi)的組織分布特點(diǎn)，為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.白芍總苷在肝損傷大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)研究
　　 1.1 色譜條件采用phenomenex C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），以乙腈-0.05％甲酸(15:85)為流動相，流速1m

3、L/min;檢測波長230nm;柱溫25℃。
　　 1.2 樣品預(yù)處理精密量取100μL血漿于空白離心管中，再加入10μL龍膽苦苷內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1min，加入50μL新鮮配制的20％高氯酸，渦旋2min，離心，提取上清液，10μL進(jìn)樣分析。
　　 1.3 藥動學(xué)參數(shù)研究采用豬血清腹腔注射法建立大鼠免疫性肝損傷模型，模型組大鼠腹腔注射豬血清0.5mL/只，每周兩次，連續(xù)10周，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，確定造模成

4、功后，按0.47g/kg、1.41g/kg、2.82g/kg三個劑量分別給正常組和模型組灌胃給予TGP藥液（10mL/kg體重），于15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、240min、360min、480min、720min眶后靜脈叢采血，HPLC法測得血漿中Pae和Alb濃度，根據(jù)藥時曲線計算藥動學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5軟件比較各組異同。
　　 2.白芍總苷在肝損

5、傷小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)研究色譜條件同1.1。采用BCG加LPS尾靜脈注射法建立小鼠免疫性肝損傷模型，模型組小鼠于第1天尾靜脈注射BCG2mg/0.2mL/只，10天后尾靜脈注射LPS7.5μg/0.2mL/只，按0.47g/kg、1.41g/kg、2.82g/kg三個劑量分別給正常組和模型組灌胃給予TGP藥液（10mL/kg體重），于15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、240min、

6、360min、480min、720min摘眼球采血，HPLC法測定血漿中Pae和Alb濃度，根據(jù)藥時曲線計算藥動學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5軟件比較各組異同。
　　 3.組織分布研究采用phenomenex C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），以不同比例的乙腈-0.05％甲酸為流動相，流速1mL/min;檢測波長230nm;柱溫25℃。各組織勻漿后，將勻漿液制成凍干粉，加入定量內(nèi)標(biāo)，以甲醇提取，10μL進(jìn)樣分析。

7、測定正常大鼠按2.82g/kg灌胃給予TGP藥液后1h、3h、6h心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸等組織中Pae和Alb的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1.白芍總苷在肝損傷大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)研究
　　 1.1 方法學(xué)研究大鼠血漿中Pae和Alb及內(nèi)標(biāo)峰在本條件下專屬性良好，Pae回歸方程為y=0.0724x-0.037(n=7,r2=0.9996，0.848μg/mL-106μg/mL),Alb回歸方程為y=0

8、.0656x-0.0092(n=7，r2=0.9998，0.4375μg/mL-35μg/mL)，日內(nèi)和日間精密度RSD均在10％以內(nèi)，準(zhǔn)確度均在100％±10％以內(nèi)，兩者和內(nèi)標(biāo)提取回收率都在70％以上，樣品預(yù)處理后室溫放置和凍融循環(huán)后仍保持穩(wěn)定。
　　 1.2 藥動學(xué)參數(shù)研究按三個劑量灌胃給予白芍總苷后，低、中、離三個劑量Pae的藥動學(xué)參數(shù)分別如下：
　　 達(dá)峰濃度正常組4.33±0.6711.68±2.0319.68

9、±4.42(μg/mL)模型組5.64±0.5314.88±2.5224.94±5.50達(dá)峰時間正常組144.00±13.42150.00±0.00144.00±13.42(min)模型組108.00±16.43114.00±13.42108.00±16.43半衰期正常組219.08±15.21228.03±21.30235.80±20.39(min)模型組284.43±54.45296.37±18.10301.28±16.91消除系數(shù)

10、正常組3.18±0.223.06±0.272.96±0.26(×10-3mL/min)模型組2.52±0.542.34±0.142.31±0.13曲線下面積0-t正常組1529.4±321.74102.0±812.67207.7±1514.4(μg.min/mL)模型組1870.9±312.05411.6±896.98798.1±1649.3曲線下面積0-∞正常組1840.1±324.44852.0±759.28428.0±1815.7

11、(μg.min/mL)模型組2466.9±296.16771.5±1124.110972.0±2079.0低、中、高三個劑量Alb的藥動學(xué)參數(shù)分別如下：
　　 達(dá)峰濃度正常組1.87±0.184.05±1.047.05±1.07(μg/mL)模型組2.44±0.525.02±0.579.10±1.43達(dá)峰時間正常組150.00±0.00150.00±0.00150.00±0.00(min)模型組114.00±13.42108.0

12、0±16.43114.00±13.42半衰期正常組220.10±17.83223.19±19.29229.23±13.33(min)模型組284.70±35.68280.95±29.60301.32±20.05消除系數(shù)正常組3.16±0.253.12±0.293.03±0.17(×10-3mL/min)模型組2.47±0.322.49±0.252.31±0.15曲線下面積0．t正常組632.5±130.01499.5±353.02797

13、.2±398.4(μg.min/mL)模型組895.6±260.11906.4±242.33509.6±875.6曲線下面積0-。正常組775.4±129.11752.9±401.33292.7±513.0(μg.min/mL)模型組1166.2±313.52448.7±304.94531.0±1014.7與正常組的參數(shù)相比，模型組低劑量芍藥苷Cmax和AUC0-∞顯著增大，Tmax明顯提前（p＜0.05或p＜0.01），芍藥內(nèi)酯苷Tm

14、ax明顯提前，t1/2明顯延長，AUC0-∞明顯增大(p＜0.05或p＜0.01)；中劑量芍藥苷Tmax明顯提前，t1/2明顯延長，AUC0-t和AUC0-∞明顯增大(p＜0.05或p＜0.01)；芍藥內(nèi)酯苷Tmax明顯提前，t1/2明顯延長，AUC0-∞明顯增大(p＜0.05或p＜0.01)；高劑量芍藥苷Tmax明顯提前，t1/2明顯延長(p＜0.01)，芍藥內(nèi)酯苷Tmax明顯提前，t1/2明顯延長，Cmax明顯增大(p＜0.05或p

15、＜0.01)。
　　 分別將正常組和模型組三個劑量芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t、AUC0-∞相比，發(fā)現(xiàn)Cmax、AUC0-t和AUC0.∞兩兩之間均有顯著性差異(p＜0.01)，而Tmax、t1/2均沒有顯著性差異(p＞0.05)，劑量與Cmax、AUC0-t和AUC0-∞均有一定的線性關(guān)系（p＜0.05或p＜0.01）。
　　 2.白芍總苷在肝損傷小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)研究按三個劑量灌胃

16、給予白芍總苷后，低、中、高三劑量Pae的藥動學(xué)參數(shù)分別如下：
　　 達(dá)峰濃度正常組3.34±0.328.53±1.0614.68±1.36(μg/mL)模型組4.35±1.049.92±0.7217.88±1.71達(dá)峰時間正常組162.00±26.83162.00±16.43150.00±21.21(min)模型組126.00±13.42126.00±25.10114.00±25.10半衰期正常組273.63±22.19268.

17、86±64.78265.39±28.60(min)模型組339.87±93.27348.73±50.44359.46±71.80消除系數(shù)正常組2.54±0.202.72±0.762.64±0.30(×10-3mL/min)模型組2.16±0.582.02±0.281.99±0.40曲線下面積0．t正常組1188.6±89.43073.2±254.45555.3±404.9(μg.min/mL)模型組1546.1±128.84133.8±

18、484.86798.5±287.8曲線下面積0-∞正常組1534.2±79.83808.6±319.26815.0±608.8(μg.min/mL)模型組2148.9±441.65588.0±607.29272.9±1222.1由于低劑量Alb血藥濃度太低，未檢測出，中劑量和高劑量藥動學(xué)參數(shù)分別如下：
　　 達(dá)峰濃度正常組3.13±0.295.16±0.36（μg/mL）模型組3.72±0.456.30±0.93達(dá)峰時間正常組1

19、62.00±16.43162.00±16.43(min)模型組120.00±21.21120.00±21.21半衰期正常組273.44±43.54273.17±48.15(min)模型組350.63±56.30342.95±34.62消除系數(shù)正常組2.59±0.422.60±0.44(×10-3mL/min)模型組2.02±0.302.04±0.20曲線下面積0-t正常組1060.9±111.01901.3±277.9(μg.min/m

20、L)模型組1278.7±83.82405.0±264.7曲線下面積0-∞正常組1335.2±116.12325.4±312.3(μg.min/mL)模型組1712.4±213.73229.3±407.1與正常組的參數(shù)相比，模型組低劑量芍藥苷Tmax明顯提前，AUC0-t和AUC0-∞明顯增大(p＜0.05或p＜0.01)；中劑量芍藥苷Tmax明顯提前，Cmax、AUC0．t和AUC0-∞明顯增大（p＜0.05或p＜0.01），芍藥內(nèi)酯苷

21、Tmax明顯提前，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞明顯增大，t1/2明顯延長(p＜0.05或p＜0.01)；高劑量芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷Tmax明顯提前，Cmax、AUC0-t和AUC0.∞明顯增大，t1/2明顯延長(p＜0.05或p＜0.01)。
　　 分別將正常組和模型組芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷劑量間的Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t、AUC0-∞相比，發(fā)現(xiàn)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞均有顯著性差異(p＜0.01

22、)，而Tmax、t1/2均沒有顯著性差異(p＞0.05)，芍藥苷劑量與Cmax、AUC0-t和AUC0-∞有一定的線性關(guān)系（p＜0.05或p＜0.01）。3組織分布3.1方法學(xué)研究各組織中Pae和Alb及內(nèi)標(biāo)峰專屬性良好，日內(nèi)和日間精密度RSD均在10％以內(nèi)，準(zhǔn)確度都在100％±10％以內(nèi)，兩者和內(nèi)標(biāo)提取回收率都在70％左右，樣品預(yù)處理后室溫放置仍保持穩(wěn)定，各組織的回歸方程如下：
　　 心 Alby=0.0564x+0.0742

23、 Paey=0.06x-0.0397肝 Alby=0.0117x-0.0151 Paey=0.0127x+0.0332脾 Alby=0.0182x+0.0135 Paey=0.0216x-0.0588肺 Alby=0.0158x-0.0342 Paey=0.0151x+0.2312腎 Alby=0.0157x+0.0045 Paey=0.0181x-0.18胃 Alby=0.0015x+0.0406 Paey=0.0017x-0.128

24、2小腸 Alby=0.0018x-0.1091 Paey=0.0019x-0.2679大腸Alby=0.0018x-0.1757 Paey=0.0019x-0.54253.2組織分布研究各時間點(diǎn)各組織中兩者濃度大小如下：
　　 1 h Pae濃度順序為：小腸＞胃＞大腸＞腎＞肝＞肺＞脾＞心Alb:小腸＞胃＞大腸＞肝＞腎＞肺＞脾＞心3 h Pae濃度順序為：小腸＞胃＞大腸＞腎＞脾＞盱＞肺＞心Alb:小腸＞胃＞大腸＞腎＞脾＞肝＞肺＞心

25、6 h Pae濃度順序為：小腸＞大腸＞胃＞腎＞肝＞脾＞肺＞心Alb:小腸＞大腸＞胃＞腎＞肝＞肺＞脾＞心除胃壁和小腸壁外，其他各組織中Pae和Alb的濃度都是在3h時達(dá)最大值，6h時小腸壁、大腸壁中Pae濃度下降到3h時的84.1％、68.1％，Alb下降到3h時的86.7％、73.9％，腎中Pae濃度下降到3h時的22.1％，Alb下降到3h時的19.2％，而其他各組織中兩者濃度都下降到3h時的20％以下。
　　 結(jié)論：

26、　　 1.通過藥動學(xué)參數(shù)研究，發(fā)現(xiàn)免疫性肝損傷模型動物體內(nèi)TGP的藥動學(xué)過程跟正常動物有所不同，肝損傷動物Tmax提前，Cmax增大，t1/2延長，AUC0-t和AUC0-∞增大，說明肝損傷病理狀態(tài)下機(jī)體對TGP的吸收速度增大，吸收量增大，消除減慢，TGP在體內(nèi)停留時間較長，提示臨床對于肝損傷患者要調(diào)整給藥量以免劑量過大引起蓄積和毒性反應(yīng)。
　　 2.通過組織分布研究，發(fā)現(xiàn)灌胃TGP后組織分布迅速且廣泛，小腸、胃、大腸及腎、脾