苯扎貝特對血小板源性生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和小凹蛋白-1表達的影響.pdf

1、目的：人工體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs),觀察過氧化物酶增生物激活受體α(PPARα)的配體苯扎貝特對血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的VSMCs的增殖及小凹蛋白-1(caveolin-1)表達的影響并探討其相應(yīng)的機制。
　　 方法：植塊貼壁法常規(guī)分離和培養(yǎng)250-300g SD大鼠的胸主動脈VSMCs,光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué),SM-α-actin單克隆抗體和免疫組織化學(xué)染色鑒定培養(yǎng)的平滑肌細胞。細

2、胞毒性實驗采用臺盼藍染色和細胞計數(shù)的方法觀察終濃度為50～200μmol/L的苯扎貝特對VSMCs的毒性反應(yīng)。選擇生長良好的第3-5代細胞用于實驗。實驗分為5組:①對照組:加入DMSO:②PDGF組:培養(yǎng)基中加入終濃度為20μg/L的PDGF-BB孵育24h;③低濃度苯扎貝特+PDGF組:培養(yǎng)基中加入終濃度為50μmol/L的苯扎貝特預(yù)處理2h后,其余處理同PDGF組;④中濃度苯扎貝特+PDGF組:苯扎貝特終濃度為100μmol/L,其

3、余處理同PDGF組;⑤高濃度苯扎貝特+PDGF組:苯扎貝特終濃度為200μmol/L,其余處理同PDGF組。采用噻唑蘭比色法檢測各組VSMCs的增殖活性,在490nm波長下用全自動酶標儀測定各孔的吸光度(OD)值。用Wester-blot方法分別測定各組caveolin-1蛋白的表達,在NBT/BCIP顯色液下顯色,顯示條帶,并通過Image J軟件進行密度分析,得出灰度值。
　　 結(jié)果： VSMCs鑒定:正常平滑肌細胞生長良好

4、,光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細胞呈長條索形、菱形,細胞核清晰,細胞邊界清楚,胞漿豐富,未見空泡。SM-α-actin單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定培養(yǎng)細胞低倍鏡下可見細胞胞漿普遍被染成黃褐色,呈陽性反應(yīng);高倍鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均勻分布SM-α-actin,表明培養(yǎng)所得細胞確實為VSMCs。細胞毒性實驗:50～200μmol/L濃度的苯扎貝特對VSMCs生長無毒性反應(yīng),VSMCs存活率達95％以上。細胞增殖的檢測:噻唑蘭比色法檢測結(jié)果顯示PDG

5、F組的24h OD值(0.487±0.019)較對照組(0.319±0.009)明顯升高,PDGF-BB能顯著誘導(dǎo)VSMCs增殖;低、中、高濃度苯扎貝特+PDGF組的24h OD值(0.308±0.012,0.224±0.011,0.146±0.013)均較PDGF組(0.487±0.019)明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)意義,不同濃度苯扎貝特對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖均有一定的抑制作用,且隨濃度增加,其抑制作用增強。Western bl

6、ot檢測:PDGF組的caveolin-1蛋白條帶灰度值(3446.57±25.58)較正常對照組(6748.13±19.10)明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)意義,caveolin-1蛋白表達較對照組明顯降低;低、中、高濃度苯扎貝特+PDGF組的caveolin-1蛋白條帶灰度值(5735.27±21.35,10854.61±35.02,16085.12±49.52)均較PDGF組(3446.57±25.58)明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義,不同濃度的苯扎

7、貝特干預(yù)后caveolin-1蛋白表達較PDGF組明顯升高,且隨苯扎貝特濃度增加,caveolin-1蛋白表達也逐漸增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.苯扎貝特對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖具有一定的抑制作用,且隨濃度增加,其抑制作用增強。
　　 2.苯扎貝特可以增加VSMCs的caveolin-1蛋白表達,其表達強度隨苯扎貝特的濃度增加而增強。
　　 3.苯扎貝特上調(diào)VSMCs的caveolin-1蛋