建立甲胎蛋白的納米抗體-RT-PCR超靈敏分析方法.pdf

1、類(lèi)號(hào)： 密級(jí)： U D C ： 學(xué)號(hào)： 405604812104南 昌 大 學(xué) 碩 士 研 究 生學(xué) 位 論 文建立甲胎蛋白的納米抗體-RT-PCR 超靈敏分析方法Establishment of a Nanobody RT-PCR Based on Ultra-sensitiveassay for Detection of AFPEstablishment of a Nanobody RT-PCR Based on Ultra-sen

2、sitiveassay for Detection of AFP陳 靜培養(yǎng)單位（院、系）：食品學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱(chēng)：許 楊 教授申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門(mén)類(lèi)：工學(xué)學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：食品科學(xué)論文答辯日期：2015.5.29答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：年 月 日摘要I摘 要 摘 要在駱駝科（Camelid）動(dòng)物的血清中存在一種天然缺失輕鏈的單域重鏈抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibo

3、dy，VHH）。VHH 僅由重鏈抗體可變區(qū)（Variable region）組成的基因工程抗體，由于分子量小，也稱(chēng)為也稱(chēng)為納米抗體。與普通抗體及重組單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）相比，VHH 具有分子小、水溶性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。甲胎蛋白分子量 69 KDa，成人血漿中含量低于 30 ng/mL。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，AFP 在血清中的含量會(huì)明顯升高，甲

4、胎蛋白就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異性臨床指標(biāo)，臨床檢測(cè)閾值為 400 ng/mL。本研究運(yùn)用納米抗體，建立了基于雙納米抗體的夾心免疫 PCR 檢測(cè) AFP，該方法靈敏度高、線性范圍廣。主要研究?jī)?nèi)容如下：1、AFP 羊駝免疫庫(kù)的構(gòu)建。AFP 免疫羊駝，采取四免血液，分離白細(xì)胞，提取 RNA。以 RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)。通過(guò)巢式 PCR，擴(kuò)增目的 VHH 基因。利用限制性?xún)?nèi)切酶 EcolⅠ 和 SfiⅠ 進(jìn)行酶切，酶切

5、產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到pHENⅠ載體中，電轉(zhuǎn)到 E.coli TG1 中。構(gòu)建的免疫庫(kù)庫(kù)容量為 1.8×108。2、免疫庫(kù)的生物淘選。采用逐輪減少 AFP 包被濃度，交換使用封阻液 BSA和 OVA，從免疫庫(kù)中獲得抗 AFP 納米抗體。經(jīng)過(guò)三輪淘選后，隨機(jī)挑取 95 個(gè)克隆，Indirect ELISA 和 Sandwich ELISA 確定與 AFP McAb 配對(duì)的陽(yáng)性克隆P-A-18、 P-A-65、 P-A-80、 P-A-83。

6、 基于噬菌體展示 VHH 建立了雙抗夾心 ELISA，最低檢測(cè)線 0.45 ng/mL，線性范圍為 1-100 ng/mL。3、陽(yáng)性克隆的原核表達(dá)。提取 P-A-18、P-A-65、P-A-80 和 P-A-83 陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶 NotⅠ 和 NocⅠ 酶切后連接到 pET25b（+） 載體上，鈣轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到 E.coli Rostta 進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。最佳表達(dá)溫度為 30℃，時(shí)間 11 h，IPTG 濃度為