核黃素受體蛋白與HpaG-,Xoo-蛋白對植物生長與防衛(wèi)反應(yīng)的影響.pdf

1、核黃素由植物、微生物產(chǎn)生。它在生物體內(nèi)形成黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，F(xiàn)MN和FAD作為黃素酶的輔酶，參與機(jī)體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應(yīng)，參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應(yīng)過程中活性氧中間體(ROIs)的產(chǎn)生。ROIs是過敏細(xì)胞壞死的重要信號，能調(diào)節(jié)生長、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應(yīng)有關(guān)。對多種植物體外施用核黃素的研究結(jié)果表明，核黃素具有促進(jìn)生長、提高作物產(chǎn)量、增強(qiáng)植物抗逆

2、能力的功效，并且能夠誘導(dǎo)植物對多種病害的抗性，啟動(dòng)不同于其它已知的抗病信號通路，起到了多效性植物生長調(diào)節(jié)劑的作用。植物中的核黃素水平很可能對抗病防衛(wèi)和生長發(fā)育過程有影響。因此，內(nèi)源核黃素含量的變化可能對一些生理生化過程產(chǎn)生影響。我們以此為切入點(diǎn)研究核黃素參與的植物防衛(wèi)和生長調(diào)控的交叉點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)室已將從中華鱉中克隆到的核黃素受體基因(riboflavin receptor protein，RIR)成功轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，

3、獲得轉(zhuǎn)基因品系RIRA，其核黃素含量、株高、株型、開花時(shí)間等多種性狀發(fā)生改變。為了進(jìn)一步研究核黃素在植物生長和防衛(wèi)過程中的作用，我們通過構(gòu)建RIR的發(fā)夾結(jié)構(gòu)得到RIR的沉默載體，轉(zhuǎn)化擬南芥RIRA，將RIR沉默，獲得沉默植株SiRB。然后比較Col-0、RIRA、SiRB三者之間核黃素含量，植株生長表型以及抗病性的差別。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因擬南芥RIRA的核黃素含量比野生型高，生長較快，開花時(shí)間提前，抗病性增強(qiáng)；而沉默品系SiRB與RIRA

4、相比，核黃素含量又有所降低，生長減慢，開花時(shí)間推遲，抗病性下降，接近恢復(fù)野生型的性狀。研究表明RIRA較Col-0產(chǎn)生的各種有益表型源于RIR的作用以及內(nèi)源核黃素含量的改變。內(nèi)源核黃素含量的升高有助于增強(qiáng)擬南芥的生長，提高擬南芥對葉斑病菌DC3000的抗病性。 人們已經(jīng)在多種動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RIR，植物體內(nèi)是否也存在核黃素受體呢?為解析這個(gè)問題作者進(jìn)行了初步嘗試。根據(jù)中華鱉RIR與雞RIR保守的功能域，從蛋白數(shù)據(jù)庫(Swiss-p

5、rot)中比對尋找到擬南芥中可能編碼RIR的基因，通過PCR方法從擬南芥cDNA中成功克隆并命名為AtRIR。構(gòu)建其原核表達(dá)體系并且通過His-Tag融合基因系統(tǒng)得到了純化的AtRIR蛋白，蛋白電泳證明蛋白質(zhì)的大小符合預(yù)測的分子量約35kD。隨后通過熒光淬滅實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)AtRIR蛋白對核黃素具有一定的結(jié)合功能。但是擬南芥中AtRIR對于核黃素的功能調(diào)節(jié)究竟能夠發(fā)揮多大的作用，尚待進(jìn)一步研究證明。本研究為進(jìn)一步解析植物核黃素信號識別與傳導(dǎo)

6、奠定了基礎(chǔ)，開辟了新域。水稻白葉枯病菌產(chǎn)生的HpaG<,Xoo>屬于hatpin類蛋白質(zhì)，可以誘導(dǎo)植物對真菌、病毒、細(xì)菌等多種病害的抗性，但能否誘導(dǎo)植物對卵菌病害的抗病性還尚待研究，作者報(bào)道了關(guān)于HpaC<,Xoo>，誘導(dǎo)煙草對疫霉菌(黑脛病菌)抗性的研究結(jié)果。我們重組表達(dá)了具有生物活性的HpaG<,Xoo>蛋白，它在煙草上引起過敏反應(yīng)的最低濃度是5μg/ml。在含有和不含HpaG<,Xoo>的固體培養(yǎng)基上煙草疫霉的生長速度無顯著差別，

7、在液體培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生孢子囊和菌絲生長的能力都無顯著差別；煙草疫霉致病相關(guān)重要基因parA1的表達(dá)也不受HpaG<,Xoo>影響。因此，證明HpaG<,Xoo>對卵菌無直接作用。煙草經(jīng)HpaG<,Xoo>誘導(dǎo)后防衛(wèi)相關(guān)基因NPR1、GST1、Chia5、PR-1b的表達(dá)水平明顯提高；HpaG<,Xoo>處理后的煙草接種煙草疫霉，黑脛病的病斑長度減小79％。可見，HpaG<,Xoo>，可以通過誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)提高對卵菌的抗性。 綜上，